目的:由病原微生物引起的食品安全事件、突发传染病疫情和生物恐怖袭击总是层出不穷、接连不断、此起彼伏,不仅危害个人健康和生命安全,而且还容易造成社会恐慌和骚乱。一旦遇到此类可疑情况,如果仅仅依托传统生物实验室对可疑微生物样本进行检测,从现场采集到样本转运、分离培养、核酸提取和检测鉴定,整个流程下来通常需要2~4天才能确定可疑样本,这显然满足不了现场快速应急处置的需求。为了提高事发现场应急处置的速度和效率,需要对微生物进行现场检测和鉴定,通常是采用RT-PCR进行核酸检测——因为基于RT-PCR的核酸检测技术特异性好、灵敏度高,已经成为微生物检测鉴定的“金标准”。目前已经存在便携式RT-PCR仪可以携至事发现场使用,然而对于微生物样本核酸的制备,仍是由操作人员手工完成,不仅费时费力、效率低下、一致性差,而且存在极高的交叉污染风险。现有的核酸自动制备仪,仅实现了核酸制备过程的“自动化”和“标准化”,虽然提高了效率和准确性,但是没有解决“通用性”和“封闭性”的问题,无法应用到现场核酸制备中。基于以上背景,本课题开展通用型封闭式微生物样本核酸现场自动制备的关键技术研究,为开发同时满足“自动化”、“标准化”、“通用化”和“封闭化”的核酸制备系统提供理论支撑和解决方案。方法与内容:本课题开展通用型封闭式微生物样本核酸现场自动制备的关键技术研究,主要从超声空化裂解细胞的机理研究、非接触式超声波微生物样本细胞裂解的方案设计和建模分析、多模联振增强理论的论证和传振膜参数的优化设计、封闭式核酸分离纯化标准化方案的建立和优化、通用型封闭式核酸自动制备平台的设计与研制等5个部分展开,分别采用的技术路线和方法是“现象观察—文献调研—流场建模—裂解建模—参数计算”、“现状分析—方案设计—建模分析—解析计算—数值计算”、“理论提出—理论论证—参数优化—平台搭建—实验评价”、“现状分析—方案设计—体系优化—平台搭建—实验评价”、“方案设计—结构设计—平台设计—样机试制—实验评价”。具体内容如下:(1)超声空化裂解细胞的机理研究通过现象观察和文献调研,分析超声空化效应能够裂解细胞的因素来源;然后建立超声空化中的流场模型,并对其运动规律进行描述;参照流场中液滴发生破裂的机理,建立超声空化流场中细胞发生裂解的动力学方程,并对相关参数进行计算。(2)非接触式超声波微生物样本细胞裂解的方案设计和建模分析鉴于现有接触式超声波裂解仪存在的诸多缺陷和不足,设计一种非接触式超声波微生物样本细胞裂解的方案;为研究核心问题,建立非接触式超声波裂解方案的简化模型;根据弹性体振动的基本理论和方程,计算传振膜模态参数的解析解;然后,基于有限元分析,计算传振膜模态参数的数值解。(3)多模联振增强理论的论证和传振膜参数的优化设计根据示例传振膜前十阶模态固有频率分布的规律,提出并论证多模联振增强理论;为保证最佳的能量传递效率,讨论并确定传振膜工作的台阶次序和模态阶数;探索曲率半径、厚度和耦合力对传振膜第二台阶频率的影响,并对各参数进行优化设计;然后搭建裂解实验平台,开展微生物样本细胞裂解实验,从形态学、裂解率和核酸检测三个方面对所设计的方案进行验证和评价。(4)封闭式核酸分离纯化标准化方案的建立和优化鉴于现有的核酸分离纯化方法不能移植到现场核酸自动制备中,设计一种增压过滤式核酸分离纯化方案;然后,对分离纯化体系进行构建和优化;根据设计的方案和优化的体系,开展微生物核酸分离纯化实验,通过pcr扩增和凝胶电泳对所设计的方案和优化的体系进行验证和评价。(5)通用型封闭式核酸自动制备平台的设计与研制基于非接触式超声波裂解方案和封闭式核酸分离纯化方案,设计通用型封闭式微生物样本核酸制备的原理方案,并对处理盒的物理结构进行设计;为了实现处理盒自动化的功能,设计通用型封闭式核酸自动制备平台,具体包括机械模块、电路模块和控制模块的设计与实现;然后,试制四通道样机,开展微生物核酸自动制备实验,从细胞浓缩富集效率、核酸产量和质量、核酸制备一致性(重复性)、核酸可检测性共四个维度对四通道样机进行性能评测。结果:按照既定的技术路线和方法,对通用型封闭式微生物样本核酸现场自动制备课题中的各个部分进行研究,均获得了预期成果。(1)超声空化裂解细胞的机理研究通过现象观察和文献调研,确定了超声空化能够裂解细胞的因素来源是机械力的作用;建立了超声空化中的流场模型——含涡流场模型,描述了超声空化流场的运动规律;建立了细胞发生裂解的动力学条件,并分别推导了大尺度涡流和小尺度涡流在细胞周围产生的动压差的数学表达式;根据细胞发生裂解的临界条件,推导了超声空化场中细胞最大稳态尺寸的理论公式;根据细胞尺度分布函数,推导了细胞裂解率的理论表达式。(2)非接触式超声波微生物样本细胞裂解的方案设计和建模分析设计的非接触式超声波微生物样本细胞裂解方案,克服了现有接触式超声波裂解仪存在的诸多缺陷;建立了非接触式超声波裂解的简化模型,分析了核心和“瓶颈”问题;根据弹性体振动的基本理论,获得了传振膜固有频率和固有振型的解析解;基于ansys模态分析,获得了特定参数(宽度w=12mm、曲率半径r=22mm、厚度t=0.4mm、受超声波探头的耦合力f=3n)传振膜前十阶模态固有频率和固有振型的数值解。(3)多模联振增强理论的论证和传振膜参数的优化设计提出并论证了多模联振增强理论,为后续优化传振膜提供了指导思想和基本原则;确定传振膜应该工作在第二台阶频率上,此时三阶模态(m3)、四阶模态(m4)、五阶模态(m5)和六阶模态(m6)发生多模联振;分别研究了曲率半径、厚度和耦合力对传振膜第二台阶频率的影响,发现g2台阶频率随着曲率半径的增加而缓慢减小,随着厚度的增加而快速增加(线性),随着耦合力的增加而缓慢减小(线性),并对各参数进行了优化设计;根据优化的参数,搭建了细胞裂解实验平台,开展微生物样本细胞裂解实验,从形态学、裂解率和核酸检测三个方面证明了所设计的非接触式超声波裂解方案能有效裂解不同类型的微生物样本细胞,实现了胞内核酸的释放,具有良好的通用性。(4)封闭式核酸分离纯化标准化方案的建立和优化设计的增压过滤式核酸分离纯化方案,满足核酸分离纯化过程对封闭化、自动化、标准化、通用性和连贯性的要求;综合考虑核酸产量和质量两个指标,优化了分离纯化体系,核酸吸附载应当选择粒径为1μm的affimagsle系列磁性微球,结合液中nacl浓度应控制在4~5mol/l,ph值控制在3~4范围内;根据优化的体系,使用增压过滤式核酸分离纯化方案的简易过滤装置,对裂解后的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和萎缩芽孢杆菌进行核酸提取,然后通过pcr扩增和凝胶电泳进行效果评测;实验结果表明,所建立的增压过滤式核酸分离纯化方案能够实现微生物样本核酸的分离和纯化。(5)通用型封闭式核酸自动制备平台的设计与研制设计了通用型封闭式核酸自动制备平台,并完成四通道样机的试制,开展微生物核酸自动制备实验;实验结果表明,在浓缩富集效率方面,微孔滤膜截留率超过90%,处理盒最大浓缩倍数为59.31倍;在核酸质量(纯度)方面,四通道样机制备的核酸纯度略低于天根公司tianampbacteriadnakit试剂盒手工制备的核酸,但od260/280均超过1.6,说明核酸纯度较高,可以用于下游检测分析;在核酸产量(浓度)方面,四通道样机在革兰氏阴性细菌核酸制备中的表现不如tianamp试剂盒,但是在革兰氏阳性细菌和细菌芽孢核酸制备中的表现均优于tianamp试剂盒,说明四通道样机具有比较优良的细胞裂解能力,但是在核酸分离纯化体系上仍需进一步优化;在核酸制备一致性方面,四个通道在6次核酸制备中的核酸产量变异系数分别为5.02%、4.96%、4.74%和5.73%,通道间的核酸产量平均(6次重复)变异系数为5.55%,样机整体变异系数为5.66%,而TIANamp试剂盒6次试验的变异系数高达17.14%,说明四通道样机在核酸制备中具有良好的一致性(重复性);在核酸可检测性方面,四通道样机制备的核酸能够直接用于RT-PCR检测,理论上最低检出限为43cfu/mL。结论:本课题了开展了通用型封闭式微生物样本核酸现场自动制备的关键技术研究,设计了通用型封闭式微生物样本核酸现场自动制备的系列解决方案,研制了满足“自动化”、“标准化”、“通用化”和“封闭化”要求的四通道通用型封闭式微生物样本核酸现场自动制备样机,并通过实验从细胞浓缩富集效率、核酸产量和质量、核酸制备一致性(重复性)、核酸可检测性等多个维度进行了性能评测。实验结果表明研制的四通道样机能够用于多种类型微生物样本的核酸自动制备,不仅浓缩富集效率高,而且制备的核酸具有较高的产量、质量和一致性,能够直接用于后级检测鉴定。因此,本课题设计的系列解决方案和研制的四通道样机能够用于现场条件中的核酸自动制备,解决了微生物现场检测鉴定中的“瓶颈”问题。