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目的:小檗碱是从黄连等药用植物中分离提取的一种异喹啉类生物碱,具有抗氧化、抗糖尿病、抗炎和抗细菌感染等多种药理活性。虽然已有研究报道小檗碱具有直接的抗菌效应,但其对巨噬细胞抗菌功能的影响并不清楚。巨噬细胞中炎症小体的活化是机体抵御细菌感染的重要机制之一。表达在病原微生物上的病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)经巨噬细胞表面或内部的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)识别以后,诱导细胞表达炎症小体组装必须的相关蛋白(如NLRP3和pro-IL-1β等),从而活化巨噬细胞;活化的巨噬细胞如果进一步受到危险信号(如胞外ATP、尿酸钠晶体等)的刺激,上述蛋白可组装成炎症小体,细胞发生程序性死亡(细胞焦亡),并释放成熟的IL-1β等产物,进一步刺激炎症反应,增强巨噬细胞吞噬和杀伤细菌的功能。为此,本课题主要研究小檗碱对ATP诱导的炎症小体活化和细胞焦亡的影响,并探索其中的可能机制,旨在了解小檗碱通过影响巨噬细胞等固有免疫细胞的功能,从而发挥间接抗菌作用的可能性和免疫药理机制。方法:(1)所用巨噬细胞:J774A.1为小鼠巨噬细胞系;原代巨噬细胞包括腹腔巨噬细胞(TGPM)和骨髓源性巨噬细胞(BMDM):腹腔注射巯基乙酸盐获取TGPM;体外培养小鼠骨髓细胞诱导分化为BMDM。(2)炎症小体活化:巨噬细胞用LPS刺激4 h后,以小檗碱处理1 h,再添加ATP激活炎症小体,以碘化丙锭染色检测细胞焦亡,以免疫印迹法检测炎症小体活化相关的标志分子,以基于微球的免疫测定法(CBA)定量分析可溶性IL-1β。(3)药物作用机制研究:利用AMPK特异性抑制剂Compound C以及siRNA敲低AMPKα抑制AMPK的活性。(4)细菌感染模型研究:小鼠腹腔注射大肠杆菌,灌胃给药,以CBA或免疫印迹分析IL-1β,流式细胞术分析腹腔中性粒细胞的百分比,组织切片分析炎症细胞浸润,琼脂糖培养分析细菌数量,同时分析小鼠存活率。结果:(1)小檗碱能剂量依赖性地增强巨噬细胞中ATP诱导的炎症小体活化,促进细胞焦亡和成熟IL-1β的释放。(2)小檗碱可增强巨噬细胞中ATP诱导的AMPK活性。(3)Compound C或AMPKα敲低阻断AMPK活性可明显逆转小檗碱对ATP诱导的炎症小体活化和细胞焦亡的促进作用。(4)小檗碱能加强体外巨噬细胞对细菌的杀伤作用,并加速体内细菌的杀伤和清除作用,降低腹腔中的细菌数量;而且,该药物还能提高腹腔中的IL-1β的水平,增加腹腔和结肠中的中性粒细胞募集,明显提高感染细菌小鼠的存活率。结论:小檗碱可能通过增强AMPK活性,促进巨噬细胞中炎症小体的活化,强化固有免疫细胞的功能,从而提高对细菌的杀伤与清除作用,间接发挥抗菌效应。