研究背景:肝衰竭是多种因素引起的严重的肝脏损害,病死率极高。慢加急性肝衰竭(acute on chronic liver failure,ACLF)是我国最常见的肝衰竭类型,是指在慢性肝病基础上出现的急性肝功能失代偿,短期中期的病死率高达50%～90%。各种急慢性肝病状态下肠道粘膜淤血水肿、蠕动减慢,导致肠道清除能力减弱,异常的微环境可进一步导致肠道微生态失衡;肠道粘膜损害、肠道原籍菌定植力减弱,从而导致肠道通透性增强,细菌及其产物进入机体导致肝脏免疫功能损伤,促进疾病的进展。近年来,肠道微生态失衡在ACLF中的作用越来越受到重视。ACLF患者肠道微生物存在怎样的失衡?失衡的菌群在疾病进展中发挥了怎样的作用?具体机制尚不明确,宏基因组学概念的提出以及高通量测序技术的发展极大地促进了生态学领域的进展,为揭示微生态与疾病的关系提供了强有力的工具。目的、方法:为阐明ACLF患者肠道菌群结构及其功能基因的改变,明确耐药基因在ACLF患者富集的情况,揭示肠道菌群在ACLF发生发展中的作用,我们采用高通量测序宏基因组学的方法对ACLF患者肠道微生物的菌群结构、功能基因及其耐药基因三方面进行研究。结果:1.利用Illumina公司的Hiseq2000测序仪对28例ACLF患者肠道微生物的宏基因组进行测序,共产生111G的测序数据,平均每个样品产生的数据为4 GB。经过组装注释,得到高质量的ACLF肠道微生物非冗余基因集,与肝硬化肠道微生物非冗余基因集进行合并,获得肝病总的基因集—即L肠道微生物非冗余基因集,其中新发现的基因有220,759个,占ACLF基因集的37%,占L基因集的7.6%。从本实验室已构建的健康对照组肠道微生物宏基因组数据库中选取28例年龄、性别、体重指数相匹配的个体的测序数据作为对照组。通过对两组的基因种类数分析,发现ACLF患者肠道基因丰度性比对照组显著减低。2.对ACLF患者肠道菌群结构分析发现ACLF患者肠道菌群的物种组成发生显著改变,两组差异的物种大多在对照组富集。在人体的营养、抗炎等方面发挥重要作用的Faecalibacterium_prausnitzii、Ruminococcaceae 等菌群在ACLF 患者中显著缺失,韦荣球菌属、链球菌属等一些口腔源性细菌在慢加急性肝衰竭患者中显著富集。通过肠型分析,我们发现了三种肠型,主要的贡献菌群分别为拟杆菌属,普氏菌属以及韦荣球菌属。通过对获得的基因标志物聚类后,发现了27个疾病相关的宏基因组物种(MGS),ACLF患者富集的MGS间大部分呈协同关系,与对照组富集的MGS呈拮抗关系。ACLF患者富集的大部分MGS与凝血酶原时间(PT)、国际标准化比值(INR)、乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)载量及其CTP评分正相关,与血清球蛋白(GLB)负相关。利用MGS构建了疾病的诊断模型,发现MGS对ACLF诊断的敏感性、特异性好,MGS的组合可以提高模型的诊断价值。ACLF患者肠道微生物的功能基因也发生显著的改变,显著富集的功能基因主要是转录、翻译及其复制和修复的基因,说明慢加急性肝衰竭患者肠道微生物处于增殖状态的比例显著升高。3.ACLF患者及其对照组肠道微生物抗生素耐药(AR)基因主要来自于变形菌门(44%),与肠道微生物的物种组成显著不同,也证实了变形菌门更容易存在AR基因。Tetq是本研究肠道微生物中相对丰度最高的AR基因型,杆菌肽的AR基因型Baca跃居为第二大AR基因型。大环内酯类、林可酰胺类和链霉素杀阳菌素类抗生素是本研究中丰度最高的AR抗生素类型,在ACLF患者中富集显著。ACLF患者肠道微生物的AR基因、AR基因个数、AR基因型数目显著高于健康对照组。结论:本研究首次全面揭示了慢加急性肝衰竭患者肠道菌群结构及其功能的失衡状态,首次明确了慢加急性肝衰竭患者肠道抗生素耐药基因及针对抗生素的种类。通过宏基因组物种研究发现失衡的肠道菌群与患者的病情显著相关,并可以对疾病进行诊断预测,为慢加急性肝衰竭的临床诊断提供新的思路,并为微生态的干预治疗提供理论基础。