菜青虫(PierisrapaeL)属鳞翅目粉蝶科昆虫,是十字花科蔬菜的主要虫害之一。菜青虫利用消化道蛋白酶降解食物蛋白质以获得其生长发育必需的氨基酸,并利用细胞色素P450等解毒酶降解宿主植物来源的抗虫次生代谢物。本研究前期研究结果表明,来自菜青虫非宿主植物决明(Cassia obtusifolia)的胰蛋白酶抑制剂(CoTI)对菜青虫有较强的抗性。本文利用分子生物学、转录组测序等技术分析喂食CoTI前后,菜青虫中肠消化酶等的转录水平变化,为研究CoTI的抗虫机制打下基础。本文首先将CoTI基因克隆到原核表达载体pET28a中,成功构建了重组质粒pET28a/CoTI,经PCR、双酶切鉴定及测序分析,表明该重组质粒含有目的基因片段,且构建正确,表达纯化蛋白并检测浓度为920μg/ml。随后对菜青虫喂食含有CoTI的白菜叶,以喂食正常白菜叶的菜青虫为对照,分别提取中肠总RNA,利用Illumina 4000测序平台进行转录组测序。测序共获得了菜青虫转录组数据17.16Gb,分别获得28,918,396和28,678,331条高质量的reads。通过Trinity软件组装共获得51,544个Unigenes。将这些Unigenes序列与公共数据库Nr、Swiss-Prot、GO、KOG、COG和KEGG等进行比对注释,,共有22,233条Unigenes获得功能注释。通过比对Nr数据库发现了相关的消化酶与解毒酶家族,105个丝氨酸蛋白酶(79个胰蛋白酶和26个糜蛋白酶,PrSPs),74个脂肪酶(PrLPs),17个淀粉酶(PrALs),113个细胞色素P450(PrCYP450s),46个羧酸酯酶(PrCXs),54个UDP-糖基转移酶(PrUGTs)和41个谷胱甘肽S-转移酶(PrGSTs)。比较对照组与实验组菜青虫中肠的转录组数据,发现有3,066个差异表达基因,并对它们进行GO分析,COG分析与KEGG通路分析等。通过分析KEGG通路发现,参与生长和发育信号通路的几个关键基因wnt、Hippo和Notch在不同的处理条件下表达有所差异,这表明CoTI可能抑制了菜青虫获得正常的生长和发育的能力。对菜青虫进行qRT-PCR内参基因选择。先从转录组数据库中筛选8个比较稳定的 Unigene,包括 Sec61、PSMD9、eIF2g、UPF3、LRE、NADH、hnRNP、THOC2作为候选内参基因,然后选择RPL32、EF1、GADPH等3个常用的内参基因一起作为候选内参基因,分析它们在菜青虫不同组织,不同发育阶段与不同胁迫条件下的相对表达水平。然后利用GeNorm与NormFinder软件分析,发现UPF3的表达水平最为稳定,因此选择UPF3作为后续定量分析的内参基因。