目的1.观察穿心莲内酯对铜绿假单胞菌生物被膜(BF)形成的干预作用,并分析药物对BF的干预作用与细菌群体感应(QS)系统的相关性,在分子水平探讨穿心莲内酯的作用机制。2.观察穿心莲内酯提高左氧氟沙星抗BF阳性铜绿假单胞菌活性的作用,探讨穿心莲内酯作为抗菌增效剂的可行性。方法1.以铜绿假单胞菌PA01野生株为研究对象,首先采用电镜技术(扫描电镜SEM和透射电镜TEM)观察穿心莲内酯在300、30、3μg·mL-1剂量下对PA01所生成的BF形态学的影响；其次采用96孔板定量测定法,定量检测穿心莲内酯在300、250、200、150、100、50、25、15、10、5μg-mL-11O个剂量下,对72h内PA01形成BF厚度的影响；最后构建体外BF渗透模型,观察穿心莲内酯在300、30、3μg·mL-1剂量下,在构建的BF模型上对左氧氟沙星渗透性的影响。以此综合分析和评价穿心莲内酯对铜绿假单胞菌BF的干预作用。2.采用实时定量荧光PCR (Real-Time PCR)技术观察穿心莲内酯在150、75、37.5μg·mL-1剂量下对铜绿假单胞菌QS系统中相关基因lasR和rhlR,以及调节基因pvdQ的mRNA表达水平的影响,分析药物对BF的干扰是否与QS系统相关。3.采用传统的体外药物敏感性实验,观察穿心莲内酯与左氧氟沙星不同配比的22个样品对160株临床近期分离BF阳性铜绿假单胞菌的MIC值,并采用概率单位分析法,对受试药物效价强度进行拟合,以残差平方和和相关系数为主要判别,进行线性、对数性、Emax和Sigmod Emax的对比,评价不同配比受试药物的抗菌活性；以PA01构建小鼠铜绿假单胞菌腹腔感染模型,观察体外抗菌活性较强的13个配比受试药物的体内抗感染作用。4.采用体内炭粒廓清实验,以吞噬指数为指标观察穿心莲内酯对正常小鼠网状内皮细胞吞噬功能的影响；采用巨噬细胞体外培养实验,观察穿心莲内酯体外对巨噬细胞吞噬作用的影响。结果1.SEM结果显示,空白对照组PA01附着于玻璃载体表面在72h可形成分化成熟、较厚、结构不均匀并密布有孔状通道的BF,TEM镜下可见PAO1聚集生长,菌体边缘清晰,周围可见呈团块,形态似“塔状”或“蘑菇状”的不规则BF结构,未见明显的培养基染色颗粒。穿心莲内酯3μg·mL-1剂量下,PAOl产生的BF未能形成成熟的结构,BF明显稀薄且平整,可见附着的PAOl菌体,TEM镜下PAOl有一定的聚集,可见少量“蘑菇状”BF结构,但较小且不明显；在穿心莲内酯30、300μg·mL-1剂量下,PA01分散附着,均未见明显的BF结构,TEM镜下PA01多数分散生长,少见聚集,菌体边缘不清晰,周围有大量颗粒状物质。2.穿心莲内酯在300、250、200、150、100、50、25、20、10、5μg·mL-110个剂量下,72h内均可影响PA01BF的生长。穿心莲内酯在20μg·mL-1以上剂量下,12、24、36、48、60、72h时BF厚度明显变薄。3.BF渗透性实验显示,穿心莲内酯在300、30、3μg.mL-1剂量下均可以提高铜绿假单胞菌生物被膜模型对左氧氟沙星的渗透性,在模型构建后的2、4、6、8、10、24h的药物渗透量显著升高。4.实时定量荧光PCR测定结果显示,穿心莲内酯在150μg.mL-1浓度下增强lasR基因表达,30、3μg.mL-1剂量下则降低其表达；穿心莲内酯在300、30和3μg·mL-1的剂量下均可降低rh1R和pvdQ基因的表达；5.体外药物敏感性实验结果显示,在左氧氟沙星比穿心莲内酯在1：0.001～1：0.01范围内,药物的Emax和ED50虽然有一定的波动,但总体趋势上表现出Emax高于单用左氧氟沙星和ED50低于单用左氧氟沙星,表明穿心莲内酯在一定剂量范围内有提高左氧氟沙星抗菌活性的作用。体内细菌感染保护性实验结果显示,所观察的13组配方对铜绿假单胞菌小鼠感染模型的体内保护性作用均优于左氧氟沙星单用。体内与体外实验结果表明穿心莲内酯可提高巨噬细胞的吞噬功能。结论穿心莲内酯可干扰PAO1生物被膜BF的产生和成熟,降低BF厚度,增强喹诺酮类药物左氧氟沙星的渗透性；抑制铜绿假单胞菌群体感应系统中lasR、rslR基因和pvdQ基因nRNA的表达,可能是其干预BF形成的作用机制；穿心莲内酯提高体外铜绿假单胞菌对左氧氟沙星的敏感性及增强巨噬细胞吞噬能力,提示穿心莲内酯可以发挥抗菌药物增效作用。