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单增李斯特菌是食源性革兰氏阳性病原体,可穿越人体三大屏障,李斯特菌溶血素S（ListeriolysinS;LLS）是一种细菌素,调节宿主的肠道微生物菌群并使细胞产生溶血反应,帮助LM跨越血肠屏障,李斯特菌溶血素O（ListeriolysinO,LLO）是LM的主要致病因子,可溶解细胞吞噬体膜帮助LM逃离吞噬体,进入胞液并增值。以本实验室已成功构建并保存的LM90SB2Δlls为基础构建LM90SB2Δlls-Δllo缺失株,进行免疫保护性试验,探究LM90SB2及其重要毒力因子缺失株的免疫原性及人工胃液耐受性。方法:1.参考F2365菌株并设计引物,PCR分别扩增hly基因的上下游同源臂,运用重叠PCR技术得到Δhly融合片段再连接温敏穿梭载体pKSV7,得到质粒pKSV7-Δhl y,测序验证后将重组质粒电转入LM90SB2Δlls感受态细胞,在氯霉素与温度的双重压力下进行传代培养使菌株完成同源重组,期间运用旁外侧引物筛选出已成功同源重组的短带缺失株,并继续在30°C且无氯霉素抗性的条件下将传代从而获得无氯霉素抗性的LM90SB2Δlls-Δllo。2.测定LM90SB2和LM90SB2Δlls-Δllo的生长曲线、利用健康昆明系雄性小鼠为实验动物通过腹腔注射感染试验测定两株菌的LD50、脑肝脾载菌量（同时采用灌服方式）等部分生物学特性,分析llsB/hly基因对LM的生长特性以及毒力的影响。3.配置人工胃液,将两株菌分别同时接种至pH=1.5、pH=2.5、pH=3.5的模拟人工胃液中,于37°C水浴,在1h、2h、3h取样,用1*PBS梯度稀释后进行平板计数（每个稀释度涂3个平板）,该试验重复2次。4.处理两株菌菌液并分别接种至小鼠并添加对照组,于14d、21d进行二免与三免。运用小鼠单增李斯特菌抗体酶联免疫分析试剂盒检测7d、14d、21d、28d的血清单增李斯特菌抗体含量。再对免疫组、对照组的小鼠腹腔注射致死剂量的LM90SB2菌液并连续观察7d小鼠状况,统计每组小鼠的免疫保护率PI。结果:1.成功构建遗传稳定缺失株LM90SB2Δlls-Δllo。2.测定生长曲线,LM90SB2的生长活性略高于LM90SB2Δlls-Δllo;小鼠LD50及脑肝脾载菌量的测定,LM90SB2的LD50为3.65*107.23,LM90SB2Δlls-Δllo不存在LD50;LM90SB2Δlls-Δllo通过口服及腹腔注射相比LM90SB2在小鼠脑肝脾中的载菌量均明显减少,差异极显著（P<0.01）。3.当pH=3.5时,两株菌的存活率为LM90SB2>LM90SB2Δlls-Δllo,当pH=2.5时LM90S B2生长及显著高于LM90SB2Δlls-Δllo（P<0.01）且随着时间的推移,两株菌生长曲线均呈下降趋势,当pH=1.5时,LM90SB2与LM90SB2Δlls-Δllo在lh分别有0.024%及0.019%的存活率,在2h亲本株依旧有0.0098%的存活率,而缺失株存活率为0%;4.通过抗体含量的测定,除第21d亲本株略高于缺失株,其余天数缺失株均略高于亲本株,通过小鼠免疫保护率结果分析,两株菌的免疫保护率均为75%,对照组的小鼠免疫保护率为30%。结论:1.成功构建了稳定遗传性的缺失株LM90SB2Δlls-Δllo;2.LM90SB2Δlls缺失hly基因后不存在LD50;相比亲本株在脑肝脾中的载菌量也极显著减少（P<0.01）;3.受试菌在人工胃液中的存活率与胃液的pH及在胃液中作用时间相关,LM90SB2Δlls-Δllo相比LM90SB2在PH=1.5、pH=2.5、pH=3.5的1h、2h、3h时在人工胃液的存活率均下降;4.llsB/hly基因缺失并不会影响LM的免疫原性,缺失株LM90SB2Δlls-Δllo对亲本株LM90SB2的侵袭具有良好的免疫保护效果,为研发LM基因缺失苗奠定了良好基础。