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膀胱癌(bladder cancer,BCa)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,在美国及大多数国家中,以移行细胞癌为主,占膀胱癌的90%以上。目前临床治疗策略的主要依据是肿瘤分期,肌层浸润性膀胱癌的首选治疗方式为根治性膀胱切除术,而非肌层浸润性膀胱癌一般推荐行经尿道膀胱肿瘤电切术。但在临床工作中发现,部分非肌层浸润性膀胱癌患者在术后短期内即很快发生复发、转移,二次手术病理表现为肌层浸润性。肿瘤复发和转移是一个多阶段、多步骤的复杂过程,而肿瘤细胞所处的微环境在其中起重要作用,而巨噬细胞是肿瘤微环境中的一种重要细胞成分。近年来研究显示肿瘤组织局部浸润的巨噬细胞,即肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs),在肿瘤组织微环境中可以发生M2型极化,从而发挥免疫抑制效应,促进瘤内血管新生、肿瘤增殖、侵犯和转移。本研究旨在探讨TAMs与膀胱癌发生、复发、进展的关系。本研究分三部分:第一部分M2型肿瘤相关巨噬细胞在预测非肌层浸润性膀胱癌初次复发的关系目的:探讨M2型TAMs浸润程度及肿瘤临床病理特征和非肌层浸润性膀胱癌(non muscle-invasive bladder transitional cell cancer,NMIBC)术后初次复发之间的关系。方法:回顾性分析我院诊治的337例初发膀胱癌患者的临床资料,以CD163为M2型TAMs分子标记物,采用免疫组化检测膀胱癌组织中TAMs浸润程度,采用χ2检验,Kaplan-Meier法进行生存分析并log-rank法检验,Cox回归模型分析TAMs浸润程度及其他膀胱癌复发危险因素,如年龄、肿瘤大小、病理分级、肿瘤数目等对肿瘤术后初次复发的影响。结果:在单因素分析中,癌间质CD163重度浸润组术后复发率为36.2%,显著高于轻、中度浸润组的16.2%(P=0.001);肿瘤大于3cm和肿瘤小于3cm患者复发率分别为14.0%和28.4%,差异具有显著性(P=0.001);多发肿瘤和单发肿瘤患者复发率分别为26.7%和14.9%,差异具有统计学意义(P=0.046);G1、G2、G3不同肿瘤病理分级复发率分别为25.0%、17.2%和22.1%,具有显著性差异(P=0.008),多发非肌层浸润性膀胱癌患者中,重度CD163间质浸润患者较轻中度更易复发(P=0.006),而单发患者中,肿瘤复发和间质浸润程度无关(P=0.144)。肿瘤小于3cm患者中,复发和间质浸润程度密切相关(P<0.01),而肿瘤大于3cm患者中,复发和CD163间质浸润程度无关(P=1.000)。肿瘤G1、G2级患者中,复发和CD163间质浸润程度密切相关,有统计学差异(P=0.035),而在G3患者中,与CD163间质浸润程度无关(P=0.505)。Cox风险回归模型分析显示CD163+细胞重度浸润、肿瘤直径>3cm、多发、高病理分级均为基层非浸润性膀胱癌复发的危险因素(P均<0.05)。患者性别、年龄、癌巢CD163细胞浸润程度无相关。结论:膀胱癌间质中CD163重度浸润者,膀胱癌术后更易复发,因此,癌间质163浸润程度是非肌层浸润性膀胱癌复发的潜在分子标记物。此外,肿瘤病理分级、肿瘤大小、肿瘤是否单发均为非肌层浸润性膀胱癌复发的独立危险因素。第二部分肿瘤相关巨噬细胞、血管内皮生成因子和肿瘤微血管密度在膀胱癌中的表达及临床意义目的:探讨肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)、血管内皮生成因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、肿瘤微血管密度(MVD)和膀胱癌发生、进展的关系。方法:以免疫组化方法检测膀胱癌组织CD68+型TAMs浸润程度,肿瘤微血管密度(以CD34为标记)及VEGF表达,每例标本均选用膀胱癌中心组织,并选正常膀胱黏膜作为对照。结果:39例正常膀胱黏膜仅有6例见CD68呈1级(15.4%),其余均为0级(84.6%);153例癌组织中CD68呈0级者5例(3.2%),1级33例(21.6%),2级69例(45.1%),3级46例(30.1%),膀胱癌中,CD68+TAMs表达较正常膀胱粘膜显著增多(P<0.01)。肌层浸润性膀胱癌和非肌层浸润性膀胱癌比较,将CD68+TAMs表达程度0级、1级、2级合并,定为轻度浸润,CD68+TAMs表达程度3级定位重度浸润。轻度浸润患者中,T1期膀胱癌98例,T2-T4期膀胱癌9例;重度浸润患者中,T1膀胱癌31例,T2-T4期膀胱癌15例。肌层浸润性膀胱癌患者中,CD68+TAMs浸润程度明显升高,两组比较有明显统计学差异(P<0.01)。肿瘤微血管密度与膀胱癌中CD68+TAMs浸润程度密切正相关(r值=0.414,P<0.01),VEGF和CD68+TAMs浸润程度也密切正相关(r值=0.333,P<0.01)。结论:膀胱癌组织中TAMs的浸润程度、MVD和VEGF表达水平较正常膀胱组织显著增高,提示TAMs可能参与膀胱癌的发生。CD68+TAMs的浸润程度与肿瘤血管密度、VEGF表达水平和膀胱癌肿瘤分期密切相关,TAMs参与膀胱癌的进展,TAMs浸润程度可以作为预后判断的一项临床指标。第三部分膀胱癌组织微环境中单核巨噬细胞的特性分析目的:探讨膀胱癌组织微环境中CD163+/CD206+单核巨噬细胞的表达特性。方法:本部分通过收集膀胱癌组织样本,利用荧光显微镜观察肿瘤组织中CD163+细胞表达;通过流式细胞检测技术分析膀胱癌癌组织和癌旁正常组织中浸润的CD45+CD14+CD163+细胞亚群表达情况,并分析与免疫和血管生成相关的分子表达情况;利用小鼠膀胱癌细胞株MB49皮下接种C57/BL6小鼠,构建荷瘤小鼠模型,以流式细胞技术检测不同时期荷瘤小鼠CD11b+F4/80+CD206+单核巨噬细胞表达的动态变化。结果:肿瘤癌灶浸润的CD45+CD14+CD163+单核巨噬细胞亚群比例较癌旁组织显著增高,两者具有显著性差异;无论癌组织还是癌旁组织,CD45+CD14+CD163+单核巨噬细胞亚群中CD40的表达显著高于CD45+CD14+CD163-群体;荷瘤小鼠实验发现,随着肿瘤生长CD11b+F4/80+CD206+单核巨噬细胞比例逐渐上升,差异具有统计学显著意义。结论:膀胱癌组织微环境中CD163+/CD206+单核巨噬细胞异常增高,且该群细胞与肿瘤进展密切相关,且发现CD40可能是该亚群发挥生物学功能的重要分子。