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基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）具有快速灵敏、分辨率高和通量高等优点,被广泛用于生物安全领域细菌、病毒及生物毒素的检测与鉴定。本研究以MALDI-TOF MS为核心,建立了高灵敏检测人类冠状病毒（Human Coronavirus,HCoV）与肉毒神经毒素（Botulinum neurotoxin,BoNT）的方法,实现了质谱技术在生物安全领域的集成应用。目前感染人的CoV共7种,其中HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1只会引起普通的感冒,症状轻可自愈,不会对公众造成巨大威胁,而严重急性呼吸综合征病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征病毒（MERS-CoV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）会导致人传人的急性呼吸道传染病,传染性、致死性及死亡率较高。HCoV感染初期症状相似,但治疗方法具有很大差异。快速准确地检测HCoVs不仅有利于在感染初期及时诊断、对症下药,对于防控急性呼吸道传染病大规模流行也具有重要意义。本研究将多重PCR（Multiplex PCR,m PCR）与MALDI-TOF MS相结合,基于单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP）位点设计引物和探针,构建了一种能够同时检测7种HCoVs的方法,命名为HCoV-MS。选择N和Rd Rp作为HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKU1的检测靶标,N、E和ORF1b作为SARS-CoV的检测靶标,N、Rd Rp、E和ORF1b作为MERS-CoV的检测靶标,N1、N2、ORF1b、S和S（D614G）作为SARS-CoV-2的检测靶标设计引物与探针,完成体系的构建。通过质粒及m PCR循环数与其他常见呼吸道病毒验证HCoV-MS的特异性,利用梯度浓度的质粒验证HCoV-MS的灵敏度,检出限为1～5拷贝/反应。将HCoV-MS应用于2020年德国罗伯?特科赫研究所组织的联合国秘书长调查机制（United Nations secretary-general’s investigative mechanism,UNSGM）实验室外部质量评估活动（External quality assurance exercises,EQAE）（EQAE-CoV-2020）,实现了考核样本中（包括高难度样本）所有HCoVs的准确鉴定。此外,对151份临床样本进行检测,检测结果与实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR,q PCR）全部一致,共检出42个D614G突变株。通过对26份梯度稀释的阳性样本检测对比了HCoV-MS与q PCR的灵敏度和特异性,发现HCoV-MS方法的特异性和灵敏度与q PCR基本一致。另外,HCoV-MS检测体系小,所需样本量很少,只需1μL样品即可进行反应,并且其通量高,30min内可完成384个样品的检测,在微量样本及大规模检测中具有优势,有望成为q PCR技术的补充,也可能为其他病毒的鉴定与突变株的进一步分型提供思路。BoNT是目前已知毒性最强的生物毒素,主要由肉毒梭菌（Clostridium botulinum）产生,目前有A～H和X共9个血清型。与人类中毒相关的血清型有A、B、E和F,其中以A型和B型为主。常见的中毒类型有食源性、医源性、创伤性及婴儿肉毒中毒。近年来,各类加工食品相继开发,食品质量良莠不齐,外食人口剧增使肉毒梭菌食物中毒事件频发。此外,由于BoNT致死量极低且相对容易制备,被一些国际恐怖势力和极端组织用来制造恐慌,对人类和平与安全构成巨大威胁。因此,针对BoNT建立快速准确的鉴定与分型方法是优化治疗、降低死亡率的必要条件,同时对维护国家生物安全也具有重要意义。BoNT的轻链是Zn2+依赖的蛋白酶,能够特异性切割神经信号传递所需的特定蛋白质。我们利用BoNT的酶活性,采用MALDI-TOF MS构建了一种对BoNT/A和BoNT/B鉴定与分型的方法,命名为BoNT-MS。通过磁珠偶联抗体富集毒素酶切底物肽段并采用同位素标记内标法实现鉴定与分型。通过优化BoNT-MS各反应成分,最终确定最佳的反应体系为p H7.2的Hepes缓冲液含有50μM Zn Cl2,10m M DTT,1mg/m L HSA,100μM底物肽段。同时还探索了不同复杂基质样本的检测,最终得到PBS基质样本中BoNT/A-MS与BoNT/B-MS的最低检出量分别为2×LD50与40×LD50,血浆基质样本中BoNT/A-MS与BoNT/B-MS的最低检出量分别为2×LD50与4×LD50,牛奶基质样本中BoNT/A-MS与BoNT/B-MS的最低检出量分别为2×LD50与4×LD50,沙土基质样本中BoNT/A-MS与BoNT/B-MS的最低检出量分别为2×LD50与80×LD50。利用BoNT-MS参加2021年德国罗伯特科赫研究所组织的UNSGM实验室外部质量评估活动（EQAE-Biotoxins-2021）,实现了对考核中多个复杂基质样本（血清、牛奶、沙土）中BoNT的鉴定。综上,本研究所建立的BoNT-MS方法可以对BoNT/A和BoNT/B进行快速鉴定与分型,该方法有望成为小鼠生物学试验的补充。综上所述,MALDI-TOF MS已日益成为一种不可或缺的检测鉴定手段,在HCoVs与BoNT/A和BoNT/B的检测与鉴定中发挥着重要的作用,适用于样本的大规模筛查检测,对国家和军队生物安全建设具有重要意义。