研究背景肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)是由多种病因引起的肺动脉压力持续升高,肺血管阻力逐渐增加为特征的心血管疾病。其主要病理表现是肺血管收缩、肺血管重构及原位血栓的形成,最终导致肺血流量明显减少,右心功能严重受限、衰竭甚至死亡,具有很大的潜在危险性,严重影响患者的生活质量和预后效果。肺动脉高压发病的原因有很多,主要有遗传、先天性、神经体液、缺氧等。目前国内外对肺动脉高压发病机制的研究主要包括遗传机制、离子通道机制、血管活性物质失衡机制、炎症及细胞机制。近年来国内外先后根据PAH发病机制的不同,开发出了 5-磷酸二酯酶抑制剂、内皮素受体拮抗剂以及前列环素类等新型的靶向治疗药物,但是这些药物仅仅使患者具有3.6年的中位生存率,仍令人堪忧。由于这些药物疗效有限,仅能使约一半左右的患者改善临床症状和心功能,且绝大多数患者会逐渐对当前的靶向治疗药物产生抵抗,疗效下降甚至消失。因此进一步深入研究PAH的发病机制有利于为开发疗效更好的靶向治疗技术奠定理论基础。缺氧在PAH的发病机理过程中起重要作用。低氧条件下,肺小动脉收缩,导致肺动脉压力升高,进而导致右心室压力升高。而长期低氧状态下,肺小动脉发生一系列病理性改变:肺动脉平滑肌细胞凋亡减少、增殖增加,内膜增厚,内径变窄,形成丛状样损害等,这种结构的变化即肺血管重构,会导致肺动脉压力进一步升高,最终导致右心室功能衰竭。低氧引起肺血管收缩反应和肺血管重构是低氧性PAH发生和发展的主要病理学基础。低氧条件下的肺血管重构是肺动脉高压发生的重要标志,其组织病理学主要表现为中膜平滑肌层的增生肥大,中膜的增厚主要由于低氧诱导肺动脉平滑肌细胞的异常增殖所致。因此,深入研究低氧诱导肺血管重构的细胞与分子机制,成为本课题研究的主要目的。人体细胞在正常状态下的能量主要来源于糖的有氧代谢,但在肿瘤细胞,其能量主要来源于糖酵解过程,在氧气充足的环境中肿瘤细胞依然进行糖酵解来获取能量,这种现象于1923年由德国科学家Otto Warburg提出,因此被称为Warburg效应。肿瘤细胞能量代谢由HIF转录因子家族所介导,肿瘤细胞通过介导HIF-1的表达,调控一系列与糖酵解、血管生成、细胞存活相关的基因,包括葡萄糖转运子(glucose transport,GLUT)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、红细胞生成素(erythropoietin,EPO)以及一些糖酵解酶类,进而促进Warburg效应的发生。近年来若干研究者认为,PAH与肿瘤在某些发病机制方面十分相似,发病过程中均出现以葡萄糖代谢类型转换为特征的Warburg效应。因此,从能量代谢的角度研究肺动脉高压肺血管重构的发生机制,为肺动脉高压的治疗提供了新的治疗方向。低氧诱导因子(Hypoxia induced factor,HIF)是Warburg效应分子机制中的关键转录因子。HIF有三个亚型,HIF-1、HIF-2和HIF-3。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β组成的异二聚体,HIF-1α是氧反应基,HIF-1β是表达基。在氧气充足的条件下,HIF-1α的两个脯氨酸残基在HIF脯氨酰羟基化酶(PHD1,2,3)的催化作用下发生羟基化,泛素蛋白酶的连接酶VHL(Von Hippel-Lindau)识别羟基化的HIF-1α,使HIF-1α泛素化,随后被蛋白组酶降解。缺氧时,HIF-1α的羟基化受到抑制,HIF-1α聚集并与HIF-1β结合形成HIF-1,HIF-1与低氧反应元件(Hypoxia responds elements,HREs)结合,激活下游靶基因的转录。其中与细胞能量代谢相关的靶基因包括葡萄糖转运子1(GLUT1)、乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)、丙酮酸脱氢酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase,PDK)等。在低氧条件下,HIF-1α表达的增加会上调PDK的表达,PDK使丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase,PDH)的活性受到抑制,从而使丙酮酸从有氧代谢向无氧代谢转换,介导Warburg效应的产生。SIRT6 是酵母沉默信息调节因子 2(silent information regulator 2,Sir2)的同源物Sirtuin家族中的一员,具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)依赖的去酯化酶和二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)核糖基转移酶活性,主要位于细胞核。能够对组蛋白和非组蛋白发生去酰化作用,也可使部分蛋白底物核糖基化。在维持基因组稳定性、能量代谢、炎症反应、细胞衰老、肿瘤以及延长寿命等调控过程中发挥重要作用。近年来,SIRT6在能量代谢途径中发挥的作用已经越来越受到人们的关注。研究发现,SIRT6既可调控组蛋白H3K9乙酰化调控糖分解相关基因,又可抑制HIF-1α而降低葡萄糖吸收、糖酵解以及线粒体呼吸以维持血糖稳态。此外,SIRT6还可通过调控糖代谢及脂肪代谢而抑制脂肪肝的形成,敲除神经系统的SIRT6则能够引起小鼠过度肥胖。由此说明SIRT6在能量代谢过程中发挥了重要的作用。本研究主要从能量代谢的角度探讨SIRT6是否通过与HIF-1α相互作用,并通过其去乙酰化酶作用抑制HIF-1α转录活性,进而阻碍下游的糖代谢途径关键分子(如PDK4等)的活化,最终可能抑制Warburg效应,逆转肺血管重构,改善PAH的预后,为PAH的治疗提供新的治疗方向。方法1、人肺动脉平滑肌细胞的培养及鉴定人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)培养于含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养基中,放于21%02、5%CO2、37℃恒温培养箱中培养,隔天换液一次,于显微镜下观察细胞的生长状态,待细胞长满培养瓶进行传代培养。通过免疫荧光染色技术检测HPASMCs的标记蛋白α-SMA,对人肺动脉平滑肌细胞形态进行鉴定。2、低氧肺动脉高压模型的构建及相关检测将HPASMCs培养瓶放于低氧装置中,充入低氧气体(3%02、5%C02、92%N2),至于37℃恒温培养箱中培养。为了检测低氧条件下HPASMCs的增殖是否具有时间依赖性,将试验分为常氧组、低氧(6h、12h、24h、36h、48h、72h)组,待各时间点结束,进行相关指标的检测:(1)、CCK-8法检测细胞的增殖:HPASMCs接种于96孔板中,3000个/孔,置于常氧和低氧条件下培养,待各时间点结束后,弃去培养基,PBS漂洗两次,向每孔中加入含CCK-8液的培养基(体积比1:10)100μl,放于37℃恒温培养箱中培养2h,然后用酶标仪测定450nm处的OD值。(2)、流式细胞术检测细胞的凋亡:待各时间点结束,弃去培养基,PBS漂洗两次,采用胰酶消化法收集细胞沉淀,加入PBS重悬制成细胞悬液,用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡。(3)、Western-Blot检测低氧条件下SIRT6、HIF-1α、PDK4蛋白的表达水平各组HPASMCs处理结束后,使用RIPA裂解液裂解细胞,提取总蛋白,BCA法进行蛋白浓度的测量,Western-Blot法检测各组SIRT6、HIF-1a、PDK4和α-tubulin蛋白的表达水平。(4)、RT-PCR 法检测 SIRT6、HIF-1α、PDK4 的 mRNA 的表达水平各组HPASMCs处理结束后,用Trizol液收集细胞提取总RNA。按照RT-PCR试剂盒说明书方法进行逆转录及上机检测各组SIRT6、HIF-1α、PDK4、β-actin的mRNA表达水平。3、免疫荧光染色检测SIRT6、HIF-1α、PDK4在HPASMCs中的位置各组HPASMCs处理结束后,分别采用SIRT6、HIF-1α、PDK4抗体进行标记,荧光标记的二抗进行染色,采用DAPI进行复染,显微镜下进行观察。4、重组腺病毒Ad-SIRT6转染HPASMCs及相关指标检测收集HPASMCs接种于6孔板中,1x105个/孔,培养于含有10%FBS的DMEM高糖培养基中,待细胞长至培养孔面积的60%进行转染腺病毒,按照MOI=50、60、75、80、90、100加入病毒液的体积。转染6h弃去含有病毒的培养基,PBS漂洗2次,换成全培于培养箱中培养48h。收集细胞进行相关指标的检测:采用Western-Blot检测感染腺病毒各组细胞SIRT6表达,RT-PCR检测感染腺病毒各组细胞SIRT6 mRNA表达水平。5、CCK-8法、EdU染色检测腺病毒转染对HPASMCs增殖的影响;Tunel染色、流式细胞术分别检测腺病毒转染对HPASMCs凋亡和周期的影响6、Western-Blot 和 RT-PCR 分别检测 HPASMCs 转染腺病毒后 SIRT6、HIF-1α、PDK4蛋白和mRNA表达水平的变化。7、统计学处理文章所有数据采用SPSS 19.0统计软件进行分析,结果以均数±标准误(X±SEM)表示。组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),当方差齐时,采用最小显著性差异法(LSD);方差不齐时采用Dennett’ s法分析。P<0.05表示差异有统计学意义。结果1、人肺动脉平滑肌细胞的培养与鉴定、免疫荧光染色对SIRT6、HIF-1α和PDK4的定位体外培养人肺动脉平滑肌细胞,采用平滑肌细胞特异性标记物α-SMA进行染色鉴定,DAPI进行复染细胞核,结果发现所有的肺动脉平滑肌细胞均呈现α-SMA染色阳性,细胞胞浆呈绿色,胞质中有条丝状物。低氧处理的HPASMCs,采用免疫荧光染色后,倒置显微镜观察发现SIRT6主要位于细胞核,HIF-1α位于细胞核和细胞浆,PDK4位于细胞核。2、低氧促进HPASMCs的增殖,减少细胞的凋亡与常氧组相比,低氧促进HPASMCs的增殖,在低氧24h、36h、48h、72h细胞增殖率显著增加(P<0.05),且其增殖具有时间依赖性。流式细胞仪检测细胞凋亡率结果显示,低氧显著降低HPASMCs的凋亡率,但低氧条件下各时间点凋亡率无显著性差异,随着低氧时间的增加晚期凋亡细胞也逐渐增加。3、低氧促使SIRT6表达下调,上调HIF-1α和PDK4的表达Western-Blot和RT-PCR结果显示,与常氧组相比,低氧使SIRT6的蛋白和mRNA表达水平降低;同时,HIF-lα和PDK4蛋白和mRNA表达水平上调;且低氧48h组HIF-1α和PDK4蛋白的表达显著上调。4、过表达SIRT6抑制HPASMCs增殖并发生G1期阻滞,促进细胞凋亡CCK-8和EdU结果显示,过表达SIRT6降低HPASMCs增殖率,与低氧组相比差异显著;流式细胞术和Tunel染色结果发现,过表达SIRT6能够显著增加细胞的凋亡率;同时,细胞周期结果显示,G1期细胞所占比例增加,S期细胞相对减少,过表达SIRT6使细胞增殖发生G1期阻滞。5、过表达SIRT6能够显著降低HIF-1α和PDK4的表达重组腺病毒SIRT6转染HPASMCs后,Western-Blot检测结果发现,转染组SIRT6蛋白表达显著上升,与常氧组相比约上调3倍,同时HIF-1α和PDK4的表达显著降低,与常氧组相比差异具有统计学意义。采用RT-PCR对各基因mRNA表达水平的检测,结果显示转染腺病毒组SIRT6 mRNA表达水平显著上调,低氧组和转染空载体组mRNA表达无差异;HIF-1α和PDK4 mRNA表达显著降低。结论1、低氧促进HPASMCs的增殖,在低氧48h增殖最显著,提示低氧诱导肺动脉高压模型构建成功。2、SIRT6参与了低氧诱导肺动脉高压肺血管重构的过程,低氧促进HPASMCs的增殖可能源于SIRT6表达的下调,引起HIF-1α和PDK4表达的上调有关。3、重组腺病毒成功转染至HPASMCs,能引起下游通路HIF-1α和PDK4表达的减少,抑制低氧诱导HPASMCs的异常增殖,促进HPASMCs的凋亡,逆转肺血管重塑。