论文部分内容阅读
研究目的:肺癌是癌症相关死亡的主要原因,作为肺癌最常见的亚型,非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC）约占肺癌总数的85%。传统的抗癌疗法（外科手术、放疗和化疗）及新兴的靶向治疗和免疫治疗在抑制癌症进展方面取得了较大成果,但NSCLC的五年生存率并未得到显著改善,这与NSCLC容易发生侵袭和远处转移密切相关。出于这个原因,研究NSCLC转移所涉及的分子机制对改善患者预后具有重要的理论意义和临床价值。蛋白激酶D（Protein Kinase D,PRKD）家族是一个保守的丝/苏氨酸激酶家族,其家族成员PRKD1在进展期胃癌、前列腺癌、乳腺癌等多种癌症中表达下调,参与癌前病变的形成及肿瘤细胞的侵袭和远处转移,被认为是预防癌前病变和肿瘤发展的一个新靶点。研究表明PRKD1在NSCLC中下调,但其具体功能机制尚不清楚。本研究旨在探索PRKD1在NSCLC侵袭转移中的作用及其潜在机制,以期为NSCLC的治疗提供新的理论依据。研究方法:1.利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）泛癌数据分析PRKD1在33种肿瘤中的表达。通过TCGA、基因表达数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）和基因表达谱交互式分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）探索NSCLC组织和正常肺组织中PRKD1的表达,分析其表达与患者临床病理特征和预后之间的联系。2.实时荧光定量PCR（real-time quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR）检测 PRKD1 在肺上皮细胞（BEAS-2B）和 NSCLC 细胞（H1299、A549、H1975 和 PC9）中的表达,并从中挑选出PRKD1表达量最高和最低的NSCLC细胞进行下一步实验。3.小干扰 RNA（small interfering RNA,siRNA）敲低 NSCLC 细胞 A549 和 H1299中PRKD1的表达或质粒过表达PRKD1后,细胞增殖、迁移和侵袭能力改变通过CCK8实验、EDU细胞增殖实验、划痕实验和Transwell实验证实。4.慢病毒感染技术构建敲低或过表达PRKD1的A549和H1299细胞。慢病毒稳转细胞分为4组:空载组（LV-NC）和PRKD1稳定过表达组（LV-PRKD1）;对照组（sh-NC）和PRKD1稳定敲低组（shPRKD1）。经皮下或尾静脉将4组A549细胞注入裸鼠体内,建立皮下瘤模型和转移模型,观察PRKD1在体内对NSCLC增殖和转移的影响。5.提取PRKD1稳定过表达组（LV-PRKD1）A549细胞及空载组（LV-NC）A549细胞的总RNA,经转录组测序,分析PRKD1过表达后相关信号通路及mRNA转录水平变化情况。根据测序结果,选定基因富集最为显著的信号通路作为PRKD1的下游信号通路继续进行研究。Western blot检测PRKD1对下游信号通路中关键蛋白表达的影响。6.免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,CO-IP）及质谱分析鉴定与PRKD1相结合的基因,选择肽段覆盖率最高的基因,利用GEO、TCGA和GEPIA数据库验证该基因在NSCLC中的表达及预后意义,分析其与PRKD1表达相关性。7.qRT-PCR检测下游靶基因在肺上皮细胞（BEAS-2B）和NSCLC细胞（H1299、A549、H1975和PC9）中的表达,A549细胞转染靶基因siRNA,通过CCK8实验、EDU细胞增殖实验、划痕实验和Transwell实验观察其敲低对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。Western blot检测靶基因敲低对下游信号通路中关键蛋白表达的影响。8.在PRKD1稳定敲低（shPRKD1）的A549细胞中,应用siRNA降低靶基因的表达,通过挽救实验进一步证实靶基因参与PRKD1所介导的NSCLC恶性生物学行为。结果:1.PRKD1在NSCLC中表达降低并与不良预后相关TCGA泛癌数据显示PRKD1在13种肿瘤中低表达。TCGA、GEO和GEPIA数据库显示,相较于正常肺组织,PRKD1在NSCLC组织中的表达更低。根据PRKD1中位表达水平,将NSCLC患者分为高低表达两组,无论是在TCGA数据库还是Kaplan-Meier Plotter网站,均发现PRKD1低表达组患者生存时间更短。2.在体外条件下PRKD1抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭qRT-PCR结果显示,与正常肺上皮细胞相比,PRKD1在4种常见NSCLC细胞中的表达明显降低,其中PRKD1在H1299细胞中表达最低,在A549细胞中表达相对较高,这两种细胞也被考虑用于后续实验。qRT-PCR和Western blot用于验证转染效率,发现转染PRKD1过表达质粒后A549和H1299细胞中PRKD1的mRNA和蛋白水平显著增加,而转染siRNA后A549和H1299细胞中PRKD1的mRNA和蛋白表达降低。CCK8和EDU细胞增殖实验表明,NSCLC细胞A549和H1299过表达PRKD1后增殖能力被明显抑制,而敲低PRKD1的表达后,细胞增殖能力明显增强。划痕和Transwell实验结果表明,上调PRKD1的表达显著抑制A549和H1299细胞的迁移和侵袭能力,而细胞迁移和侵袭能力在下调PRKD1的表达后增强。3.在体内条件下PRKD1抑制NSCLC细胞的增殖和转移裸鼠皮下瘤模型显示,LV-PRKD1组肿瘤生长速度缓慢,皮下瘤体积和重量也明显较小,而shPRKD1组肿瘤生长速度更快,皮下瘤体积和重量也更大。免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）染色再次证实LV-PRKD1组增殖指标Ki67表达下降。转移模型结果表明,LV-PRKD1组和LV-NC组裸鼠肺部均发现了转移灶,但LV-PRKD1组肺脏转移灶数量远低于LV-NC组。4.PRKD1对Wnt/β-catenin信号通路具有调节作用测序结果显示,PRKD1过表达后,差异基因（log FC＞2,P＜0.05）显著富集在Wnt信号通路。Western blot结果显示在A549和H1299细胞中,PRKD1过表达抑制Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白β-catenin、c-myc、c-Jun的表达,PRKD1敲低则增加β-catenin、c-myc、c-Jun的表达。这些变化与增殖和迁移实验结果相一致,因此我们推断PRKD1参与调节NSCLC中Wnt/β-catenin信号通路以发挥肿瘤抑制作用。5.EIF5A在NSCLC中高表达并与不良预后相关CO-IP及质谱分析结果表明,EIF5A可以与PRKD1相结合。GEO和TCGA数据库显示在NSCLC中EIF5A与PRKD1表达显著负相关,且相较于正常肺组织,EIF5A在NSCLC组织显著上调。根据EIF5A的中位表达水平,将NSCLC患者分为高低表达两组,无论是在TCGA数据库还是Kaplan-Meier Plotter网站,均发现EIF5A高表达组患者的生存时间较短。6.下调EIF5A抑制NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭qRT-PCR结果显示,与正常肺上皮细胞相比,EIF5A在4种常见NSCLC细胞中的表达相对较高。qRT-PCR和Western blot用于验证转染效率,发现转染siRNA后A549细胞中EIF5A的mRNA和蛋白表达降低。CCK8和EDU细胞增殖实验显示,下调EIF5A表达后A549细胞增殖能力被明显抑制。划痕和Transwell实验表明,下调EIF5A表达后细胞迁移和侵袭能力同样抑制。Western blot结果显示,敲低EIF5A表达后,Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白 β-catenin、c-myc、c-Jun 的表达下调。7.EIF5A参与PRKD1所介导的NSCLC恶性生物学行为在稳定敲低PRKD1的A549细胞中,瞬时转染siRNA敲低EIF5A的表达,结果显示EIF5A能在一定程度上挽救敲低PRKD1所引起的细胞增殖侵袭能力增强,并能挽救敲低PRKD1引起的Wnt/β-catenin信号通路激活。结论:1.PRKD1在NSCLC中低表达,并与不良预后相关。2.过表达和敲低PRKD1能够分别有效抑制和促进NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭、裸鼠成瘤、肺转移能力及Wnt/β-catenin信号通路。3.EIF5A在NSCLC中高表达并与PRKD1表达呈显著负相关,EIF5A敲低能够抑制NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭能力,并抑制Wnt/β-catenin信号通路。4.PRKD1在NSCLC中通过调控EIF5A的表达,进而抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力以及Wnt/β-catenin信号通路。