背景肿瘤特异性标志物检测是当前肿瘤诊断的重要方法,现行检测技术包括非常成熟的免疫组织化学染色(immunohistochemical staining, IHC)及免疫荧光标记(immunofluorescence label),这些方法对离体肿瘤组织及细胞特异性标志物的检测已得到广泛的认可。但随着肿瘤研究的不断深入,需要更为有效方法对生理环境下肿瘤生物学行为进行相关研究,提供最为直接的肿瘤增殖、浸润及转移的证据；同时,对在体肿瘤的可视化识别,实现术中精确定位,也是目前提高肿瘤诊治水平的关键。量子点(quantum dots, QDs)因其独特的荧光效应可满足人们对生理环境下在体目标示踪的要求,作为一种新型的纳米荧光探针,其在生物医学的多个领域均有广泛的应用前景,特别是在肿瘤研究领域可改善目前肿瘤在体研究中存在的方法上的不足。但是,这一新兴的标记技术在生物医学的实际应用中尚处于初始阶段,其作为生物标记探针是否能满足生物应用中标记敏感性及特异性的要求,以及是否具有良好的稳定性和实际操作的可行性均需要进行探讨。本研究在膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma, BUC)及前列腺癌(prostate cancer, Pca)组织标本中分别利用QDs对肿瘤标志物进行特异性标记,并与传统的IHC及异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记相比较,对其应用特征进行了初步的探讨,为其生物应用的可行性进行了实际的验证。目的比较链霉亲和素标记的QDs (QDs-SA)与IHC对BUC组织标本中前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen, PSCA)的检测,及通用型二抗标记的QDs探针(QDs-IgG)与FITC探针(FITC-IgG)对前列腺癌(Pca)组织标本中前列腺特异性抗原(PSA)的标记检测,初步探讨QDs作为新型生物荧光探针的生物医学应用的实际价值。方法分别对96例BUC组织中PSCA的表达进行QDs-SA 605荧光标记和IHC染色,对72例Pca组织标本进行QDs-IgG 545和FITC-IgG荧光标记,在荧光显微镜下,根据染色/荧光信号的强弱对所获结果进行判读,并以3+,2+,1+,0分别表示阳性表达的强,中,弱和无。结合肿瘤的分级和分期资料,分别对QDs-SA 605标记与IHC染色,以及QDs-IgG 545与FITC-IgG标记的结果进行比较研究,分析QDs-SA605和QDs-IgG 545与传统标记方法比较,对肿瘤抗原特异性检测的异同,并采用Kappa分析进行一致性检验。同时,分别对QDs-SA 605和QDs-IgG 545标记后的荧光强度的衰减过程进行观察记录。此外,在QDs-SA 605荧光标记部分,还利用其对体外培养的细胞进行了标记,并利用能发射不同颜色荧光的QDs-SA探针(QDs-SA 605和QDs-SA 545)对BUC组织进行了双色同时标记。结果1.QDs-SA 605标记与IHC染色对BUC组织标本PSCA的检测结果QDs-SA 605标记和IHC染色均显示PSCA的阳性表达率均随着BUC浸润程度的升高而逐渐降低,在Ta, T1, T2, T3, T4期标本中,QDs-SA 605标记显示的阳性表达率分别为100%,93%,89%,83%,40%,IHC染色显示的为100%,90%,89%,83%,40%；同时,两者也显示PSCA的表达强度随BUC病理分级的升高而逐渐增强,特别是强阳性表达的比例更为明显,在病理Ⅰ级,Ⅱ级和Ⅲ级的组织标本中QDs-SA 605标记显示的强阳性表达率为10%,21%和58%,在IHC染色显示的结果分别为10%,21%和50%。两种方法kappa分析K值为0.74,假设检验计算得出z值为11.1,查得p<0.001,说明QDs-SA 605标记和IHC染色对BUC组织标本中PSCA的检测具有一致性。2. QDs-SA荧光双标与培养细胞的标记元激发下可同时观察到QDs-SA 605的橘红色荧光和QDs-SA 545的绿色荧光对两种肿瘤标志物的标记结果,能清楚显示出两种肿瘤标志物在细胞内不同位置的表达;QDs-SA 605对T24细胞PSCA标记后在激光共聚焦显微镜下可清楚观察到PSCA定位于细胞表面。3. QDs-IgG 545和FITC-IgG荧光标记对Pca组织标本PSA的检测结果QDs-IgG 545和FITC-IgG荧光标记均显示PSA的阳性表达率及表达强度随Pca组织Gleason评分和肿瘤TNM分期的升高而逐渐降低,在Gleason评分2-4分,5-7分和8-10分组中,QDs-IgG 545标记显示的PSA阳性表达率分别为100%,78.6%和36%,FITC-IgG标记为100%,78.6%和32%；在T1到T4期的组织标本中,QDs-IgG 545标记显示PSA的阳性表达率分别为100%,69%,62%,38%, FITC-IgG荧光标记为100%,65%,62%,38%。同时,两种方法也显示了PSA的强阳性表达率也随Pca组织Gleason评分和肿瘤分期的升高而逐渐降低。两种方法kappa分析K值为0.90,假设检验计算得出z值为12.2,查得p<0.001,说明QDs-IgG 545和FITC-IgG荧光标记对Pca组织标本中PSA的检测具有显著的一致性。4. QDs-SA 605与QDs-IgG 545标记后荧光持久性观察QDs-SA 605标记后在实验当天,10天,30天时对荧光强度的变化进行了观察记录,实验当天96例标本中有83例标本有阳性荧光信号,其中1+,2+和3+强度的例数(比例)分别为8例(8%),40例(42%),35例(36%)；实验10天后除少数几例荧光强度变化外,多数保持稳定,此时1+,2+和3+强度分布为10例(10%),39例(41%),33例(34%)；30天时分别为49(51%),29例(30%),0例(0),阳性荧光信号能持续一个月的比率约为94%(78/83)。QDs-IgG 545标记后在实验当天,10天,20天,30天时对荧光强度的变化进行了观察记录,实验当天72例标本中有50例标本有阳性荧光信号,其中1+,2+和3+强度的分别为20例(27.8%),25例(34.7%),5例(6.9%)；10天时,只有1例的荧光有变化,此时强度分布为20例(27.8%),26例(36.1%),4例(5.6%)；20天时,荧光强度变化较剧烈,但总的阳性荧光信号率仍未变,强度分布为27(37.5%),23例(31.9%),0例(0)；到30天时,有9例荧光已衰减到0,此时强度分布为38(52.8%),3例(4.2%),0例(0),阳性荧光信号能持续一个月的比率约为82%(41/50)。结论QDs荧光探针对肿瘤组织标本特异性标志物的检测具有同传统公认方法相一致的检测效能,能利用标记后荧光的强弱对不同分期和分级的BUC及Pca组织标本中相关肿瘤抗原的不同表达强度进行精确显示,其标记后的荧光强度在相当长的时间内可保持稳定,能满足生物医学实际应用的要求。文中两种形式的QDs荧光探针对肿瘤组织的良好标记效果,及其对肿瘤细胞的标记和肿瘤组织的双色标记,显示了QDs荧光探针在肿瘤研究领域广阔的应用前景,为其在肿瘤研究中的进一步应用奠定了基础。