研究背景和目的下咽鳞状细胞癌(Hypopharyngeal squamous cell carcinoma,HSCC)是起源于上消化呼吸道粘膜上皮的恶性肿瘤,其发病率约占头颈部恶性肿瘤1.4～5%,占全身恶性肿瘤的0.5%。下咽鳞癌发生于下咽部的梨状窝区,环后区及下咽后壁区,其中发生于梨状窝区最常见,发生率约为70～80%,下咽后壁区约为5～22%。在全部下咽肿瘤的病理类型中,鳞状细胞癌约占90%,其次为腺癌,腺鳞癌,肉瘤等。下咽鳞癌患者的早期临床表现并不显著,仅表现为咽部不适或咽部异物感。随着肿瘤的浸润性生长,肿瘤发生破溃,患者可出现咽部疼痛。若肿瘤侵及喉部或声门旁间隙,患者可出现声音嘶哑、呼吸困难,而食道受累则会出现吞咽困难。下咽鳞癌患者淋巴结转移率非常高,部分患者以颈部淋巴结肿大为首发症状,咽部症状可不明显。早期下咽鳞癌(Stage Ⅰ-Ⅱ)的5年生存率可高达70%,但由于其症状的不典型性及发病部位的隐匿性,极少的患者能在早期被发现。约70-85%的患者就诊时,肿瘤已发展为中晚期(Stage Ⅲ-Ⅳ),患者5年生存率仅为15-45%。下咽鳞癌的治疗包括以手术为主辅助以术前或术后放化疗或以放疗为主的综合性治疗方案。虽然近年来下咽鳞癌的治疗方法不断进步,下咽鳞癌患者的预后仍远远不能令人满意。因此,进一步探索、发现下咽鳞癌高敏感性和特异性的肿瘤标记物,并寻找新的治疗靶点已成为一项十分迫切的任务。经典的分子生物学理论指出遗传信息通过基因编码的形式进行传递,RNA仅在DNA序列和编码蛋白质之间起媒介物的作用。随着分子生物学理论和人类基因组计划的发展,人们认识到,在人类基因组中仅有1.5%的基因为蛋白质编码基因,而90%以上的基因转录为不具有蛋白质编码功能的非编码RNA(noncoding RNAs)。长链非编码RNA是长度大于200个核苷酸,缺少有意义的开放阅读框而不具有蛋白质编码功能的RNA,约占全部非编码RNA的80%。通过调控基因表达等途径,LncRNA广泛参与了细胞生命活动的众多过程,如细胞的增值,分化以及染色体的失活等。迄今为止,多个LncRNA已被证实能够在转录、转录后水平以及通过表观遗传学机制,调控基因的表达,这其中包括:染色体的修饰,维持mRNA稳定性及阻碍miRNA对mRNA的降解等。在肿瘤研究领域,LncRNA也显示了重要的调节功能。研究发现,LncRNA可以调控肿瘤细胞的凋亡、增殖、细胞周期以及转移等生物学行为。并且,研究者在越来越多的肿瘤中发现了 LncRNA的重要调节功能,其中包括:乳腺癌,肺癌,胰腺癌,骨肉瘤,肝细胞肝癌,白血病等。LncRNA在一系列的恶性肿瘤中异常表达,间接说明了其同时具有促进肿瘤形成和肿瘤抑制双重角色。目前,大多数癌症的生物标记物都是蛋白质编码基因,蛋白质编码基因的转录产物或蛋白质本身。而近年来,非编码RNA却成为了该领域的一大热点,多种LncRNA被证实可以作为全新的肿瘤标志物以及潜在的治疗靶点。尿路上皮癌胚抗原1(Urothelial carcinoma-associated 1,UCA1)就是一种具有显著特征的LncRNA。LncRNA-UCA1最初被发现在膀胱移行细胞癌中高表达,属于人内源性逆转录病毒H家族,cDNA全长1439bp。进一步的研究发现LncRNA-UCA1有明显的促进膀胱癌形成并增强其侵袭能力的作用。此外,LncRNA-UCA1在其他恶性肿瘤中也呈现出差异性表达,表现为与癌旁组织相比,在癌组织中不同程度的高表达,并促进肿瘤的形成。更多的研究表明,LncRNA-UCA1在多个肿瘤同样起到了癌基因的作用。比如,Zuo等发现TGF-p1可诱导LncRNA-UCA1表达上调促进胃癌的侵袭和转移。Zhou等发现LncRNA-UCA1在前列腺癌组织中表达上调且与患者的预后不良相关。Zhao等发现LncRNA-UCA1能够促进神经胶质瘤细胞的增殖并能够通过其表达水平对患者的预后进行预测。Xiao等发现LncRNA-UCA1能够通过miR-203调控Snail2基因的表达,进而促进肝细胞肝癌的进展。根据这些研究,我们提出疑问LncRNA-UCA1是否可以用来作为下咽鳞状细胞癌的诊断指标、或评价其预后呢?另外,LncRNA-UCA1会通过哪些途径来影响下咽鳞状细胞癌的生物学行为呢?为此,我们首先对下咽鳞癌及癌旁组织进行了高通量LncRNA芯片筛查。实验结果显示,众多LncRNA在下咽鳞癌组织中相对癌旁组织显著高表达,其中也包括LncRNA-UCA1。根据此结果,我们推测LncRNA-UCA1在下咽鳞癌中也可能作为癌基因对肿瘤的发生发展起促进作用。本课题进行了以下2个部分的研究,(1)采用qRT-PCR的方法检测53例下咽鳞癌及对应癌旁组织标本中LncRNA-UCA1的相对表达量,分析其与下咽鳞癌患者临床病理特征的相关性,并且评价LncRNA-UCA1的表达量与下咽鳞癌患者预后的关系(2)构建干扰LncRNA-UCA1表达的慢病毒载体,并通过细胞凋亡实验,细胞周期检测实验,细胞克隆形成实验,细胞transwell实验等进一步研究LncRNA-UCAl对下咽鳞癌细胞生物学行为的影响。第一一分 LncRNA-UCA1在下咽鳞癌中的表达及临床意义研究目的检测下咽鳞癌患者肿瘤组织及癌旁组织中LncRNA-UCA1的相对表达量,并进一步分析LncRNA-UCA1的表达与下咽鳞癌患者临床病理特征及预后的关系。研究方法收集山东大学齐鲁医院耳鼻咽喉科2011年3月至2011年12月行下咽鳞癌切除患者的肿瘤组织及相对应的癌旁组织共53对,采用qRT-PCR(quantitative real-time PCR)的方法,检测LncRNA-UCA1在下咽鳞癌及癌旁组织中的相对表达量,并统计患者的临床病理特征及预后。LncRNA-UCA1的表达量与临床病理特征的关系用Chi-square或Fisher精确检验评估。T检验用于比较两个实验组数据之间的差异。Kaplan-Meier法用于绘制LncRNA-UCA1高表达或低表达患者的生存曲线。Log-rank法用于比较患者的总体生存率。研究结果LncRNA-UCA1在下咽鳞癌组织中的相对表达量为(0.0088 ±0.0050),明显高于LncRNA-UCA1在癌旁组织中的表达量(0.0051 ±0.0040,P<0.05)。高表达的LncRNA-UCA1与更差的T分级(P = 0.034),更晚的临床分期(P = 0.021)及阳性淋巴结转移(P=0.02)均显著相关。而LncRNA-UCA1的表达与其他临床病理特征未发现有显著的相关性,如患者的年龄(P = 0.213),肿瘤的分化程度(P = 0.613)。另外,我们还发现,以LncRNA-UCA1相对表达量的中位数为界,将患者分为LncRNA-UCA1高表达组和低表达组。LncRNA-UCA1高表达组的总体生存率要明显低于低表达组(P<0.0001)。研究结论LncRNA-UCA1在下咽鳞癌中呈高表达状态且LncRNA-UCA1的表达水平与下咽鳞癌的T分级、临床分期、淋巴结转移,以及患者总体生存率均明显相关。而与患者的年龄,肿瘤的分化程度无明显相关性。由此说明,LncRNA-UCA1可能促进了下咽鳞癌的发生发展并且可以做一个评价下咽鳞癌患者预后的生物学指标。第二部分 LncRNA-UCA1对下咽鳞癌细胞功能的影响研究目的研究LncRNA-UCA1对下咽鳞癌细胞凋亡,增殖,侵袭及迁徙等细胞功能的影响研究方法构建LncRNA-UCA1低表达慢病毒载体,并将病毒感染人咽鳞癌细胞株FaDu细胞,qRT-PCR法检测LncRNA-UCA1在FaDu细胞中的表达并评估干扰效率。细胞凋亡实验,细胞克隆形成实验及细胞周期实验检测LncRNA-UCA1对FaDu细胞增殖能力的影响,transwell实验检测LncRNA-UCA1对FaDu细胞侵袭及迁移能力的影响。研究结果qRT-PCR法检测结果显示干扰UCA1转染FaDu(Sh1 and Sh2)组细胞的LncRNA-UCA1的表达水平明显低于Control组细胞(P<0.05)。流式细胞仪检测LncRNA-UCA1对FaDu细胞凋亡的影响。结果示,转染5天后,低表达LncRNA-UCA1FaDu细胞的凋亡比例较对照组明显增高(P<0.05)。流式细胞仪检测LncRNA-UCA1对FaDu细胞周期的影响,结果示,相比于对照组,降低LncRNA-UCA1的表达能够明显的诱导FaDu细胞聚集于G0/G1期,减少S期的细胞聚集(P<0.05)。细胞克隆实验检测LncRNA-UCA1对FaDu细胞的增殖能力的影响。结果示:低表达LncRNA-UCA1的相对对照组,减少了 FaDu细胞的克隆数(P<0.05)。transwell实验检验LncRNA-UCA1对细胞侵袭和迁移能力的影响。结果示,相比于对照组,降低LncRNA-UCA1的表达能够明显减低侵袭和迁移能力(P<0.05)。研究结论LncRNA-UCA1能够促进下咽鳞癌细胞增殖,抑制其凋亡,并提高下咽鳞癌细胞的侵袭和迁移的能力。