黑眶蟾蜍(Buffo melanostictus)为无尾目,蟾蜍科,蟾蜍属。黑眶蟾蜍主要分布在中国境内的云南、四川、贵州、江西、福建等地,南亚、中南半岛及东南亚等地也广泛存在。黑眶蟾蜍的皮肤是蟾衣的主要来源,蟾衣性辛、凉,在中医中作为一种广泛的中药材,虽然其活性成分不清楚,但是有消水利肿,清热解毒,抗癌止痛等多种功效。丝氨酸蛋白酶抑制剂是主要的蛋白酶抑制剂之一,广泛存在于动物、植物以及微生物体内。丝氨酸蛋白酶抑制剂作为维持生物体内环境稳定的重要因素,其在生物生理和病理过程中起着重要的调节作用,一旦平衡失调即会引发严重的病理性疾病。在本研究中,通过提取黑眶蟾蜍的皮肤总RNA构建cDNA文库,根据保守结构域胰蛋白酶Inhibitor like cysteine rich domain设计简并引物,进行巢式PCR获得部分黑眶蟾蜍胰蛋白酶抑制剂3’末端序列后,再次设计引物扩增5’部分序列,最终成功的克隆得到2条黑眶蟾蜍胰蛋白酶抑制剂序列,命名为Hylaserpin analogues 1和Hylaserpin analogue 2。BLAST分析显示其与华西雨蛙(Hyla simplex) hylaserpin S2等丝氨酸蛋白酶抑制剂具有相似性。对Hylaserpin analogues 1和Hylaserpin analogue 2预测显示都是单一的非糖基化多肽链,分别由110和83个氨基酸残基构成,其中Hylaserpin analogue 2由24个氨基酸残基构成的信号肽和59个氨基酸构成的成熟肽组成。通过大肠杆菌原核表达技术,纯化得到了Hylaserpin analogues的重组蛋白,这两个蛋白都具有强烈的胰蛋白酶抑制活性,Hylaserpin analogues 1和Hylaserpin analogue 2的对人源胰蛋白酶的Ki分别为1.90μM和2.20 μM。随着Hylaserpin analogues浓度的增高,Hylaserpin analogues对胰蛋白酶的抑制作用越来越强。在2μM浓度时,18s时Hylaserpin analogue 1对胰蛋白酶的抑制率达到36%,3 min时抑制率达到62%,Hylaserpin analogue 2在18s时对胰蛋白酶的抑制率达到20%,3 min时抑制率达到24%。在8μM浓度下,18s时Hylaserpin analogue 1对胰蛋白酶的抑制率达到46%,3 min时抑制率达到78%；而Hylaserpin analogue 2在18s时对胰蛋白酶的抑制率达到 39%,3 min时抑制率达到47%。在本研究中所获得的Hylaserpin analogues具有很强的胰蛋白酶抑制活性和广泛的pH适应性,这些特性能使其运用在宿主免疫和肿瘤治疗中。