甘蓝型油菜(Brassica napus L.)对低硼胁迫非常敏感,缺硼导致油菜籽粒产量严重下降。我国油菜主产区的土壤普遍缺硼,虽然增施硼肥可以缓解油菜缺硼,但是硼矿属于不可再生资源,且施肥不当易造成作物硼中毒现象。因此,筛选甘蓝型油菜硼高效种质资源、揭示硼高效的生理与分子机制,对于油菜的优质高产具有重要的理论与实践意义。课题组前期已筛选获得甘蓝型油菜硼高效和硼低效种质,并在此基础上开展了硼高效生理机制和遗传基础方面的研究。但是硼高效的机制非常复杂,不仅涉及硼的吸收、转运和分配,而且还涉及激素代谢、活性氧与钙信号的调控,甚至还存在植株细胞、组织和器官之间的相互作用等。本研究以甘蓝型油菜硼高效基因型‘QY10’和硼低效基因型‘W10’的下胚轴为外植体建立了悬浮细胞体系,同时结合油菜植株体,利用各种现代物理、化学、分子生物学研究手段及显微观察技术,从植物激素、细胞壁果胶、活性氧与钙信号等方面系统研究了硼高效的机制,主要获得如下结果:1甘蓝型油菜悬浮细胞体系的建立及响应低硼胁迫的基因型差异以甘蓝型油菜基因型‘QY10’和‘W10’的下胚轴为外植体,建立了油菜悬浮细胞的培养技术,研究了油菜悬浮细胞对低硼胁迫的响应和基因型间的差异。随着介质硼浓度的减小,细胞活性显著降低,畸形细胞数目明显增多。在0.1μM和0.25μM硼浓度下,‘W10’的悬浮细胞数量与活性均显著低于‘QY10’,说明油菜硼效率的高低在单细胞水平即存在显著的基因型差异。该体系不仅适用于甘蓝型油菜硼效率的鉴定,也可以作为单细胞水平下研究甘蓝型油菜的一种手段。2果胶介导的细胞壁力学性能的差异赋予了油菜基因型不同的低硼敏感性利用扫描与透射电子显微镜观察发现缺硼时‘W10’悬浮细胞细胞壁加厚,易破裂。进一步利用原子力显微镜检测发现缺硼时‘W10’细胞壁力学性能显著弱于‘QY10’,然而两基因型在正常硼或者缺硼条件下去除果胶,细胞壁力学性能的差异消失,说明果胶是导致‘QY10’和‘W10’低硼敏感性不同的重要因素。随后我们发现‘W10’的果胶浓度显著高于‘QY10’,而且缺硼时‘W10’细胞壁上存在更高比例的RG-II单体,从而导致细胞壁结构不稳定。通过数字基因表达谱与定量PCR验证,均发现‘W10’果胶合成相关基因的表达量显著高于‘QY10’。通过分析油菜自然群体中硼高效与硼低效基因型的果胶浓度及其RG-II单体(m RG-II)与二聚体(d RG-II)比例,证实了细胞水平上的研究结果,说明油菜细胞壁较低的果胶浓度更有利于植株抵抗低硼胁迫。3油菜植物激素及相关基因响应低硼胁迫的时空模式数字基因表达谱结果显示,低硼下不同硼效率基因型间激素相关基因的表达存在显著差异。我们重点研究了生长素、茉莉酸和脱落酸对低硼胁迫的分子响应,长期低硼胁迫降低了生长素的浓度及其合成与输出基因的表达,增加了茉莉酸和脱落酸的浓度,诱导了脱落酸合成与受体基因的表达。低硼胁迫下,硼低效材料‘W10’茎尖与根中的生长素浓度和输出基因的表达量均显著下降,它们可能分别促进了侧枝萌发和抑制了根系生长。进而我们发现外源添加生长素可以显著缓解‘W10’的缺硼症状。上述结果说明缺硼时生长素代谢的紊乱是导致植株出现生理缺陷及基因型差异的重要因素。4活性氧和钙离子信号参与油菜不同基因型对低硼胁迫的差异反应低硼胁迫下,活性氧在根尖累积部位与根中细胞大量死亡的区域一致。低硼胁迫下,无论是植株根系还是悬浮细胞,‘W10’超氧阴离子增加的幅度均显著高于‘QY10’,添加外源超氧阴离子清除剂能显著缓解细胞死亡。过氧化氢变化趋势与超氧阴离子类似,但是没有超氧阴离子变化剧烈,外源过氧化氢清除剂对缓解细胞死亡效果不显著。缺硼导致‘W10’细胞质膜稳定性降低,同时造成严重的离子渗漏,包括钾离子外流。低硼胁迫诱导钙离子内流,利用钙离子通道抑制剂预处理根系发现活性氧累积减少,说明钙离子信号在活性氧的上游发挥作用。通过测定编码活性氧产生酶基因的表达与抗氧化酶的活性,发现低硼胁迫时基因型间活性氧积累的差异取决于活性氧的产生,而非活性氧的清除能力。