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第一部分脂氧素受体激动剂BML-111对大鼠机械通气肺损伤炎症反应的影响目的建立大鼠机械通气肺损伤模型,研究不同剂量脂氧素受体激动剂BML-111对机械通气肺损伤炎症反应的影响,以便进一步探讨其作用机制。方法SPF级雄性SD大鼠48只,6-8周龄,体重200-250g,随机分为六组(n=8)：(1)假手术组(sham),进行所有手术操作,保留自主呼吸；(2)小潮气量机械通气组(LVT)：潮气量6ml/kg;(3)大潮气量机械通气组(HVT)：潮气量20ml/kg;(4) O.lmg/kg BML-111干预组(BML(0.1))：潮气量20m1/kg,机械通气开始时腹腔注射BML-111(0.1mg/kg);(5) lmg/kg BML-111干预组(BML(1))：潮气量20ml/kg,机械通气开始时腹腔注射BML-111(lmg/kg);(6) BOC-2加BML-111干预组(BOC+BML (1)),潮气量20ml/kg,机械通气开始前30min腹腔注射BOC-2(50μg/kg),机械通气开始时腹腔注射BML-111(1mg/kg)。机械通气各组呼吸频率均为80次/分,机械通气时间均为4h。实验结束时查动脉血气分析,然后颈动脉放血处死大鼠,收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)及肺组织标本。光学显微镜下观察大鼠肺组织HE染色病理变化并进行肺损伤评分；测定大鼠肺组织湿／干重比(wet/dry weight ratio, W/D)、肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性；检测BALF中的总蛋白浓度；对BALF中细胞进行分类计数；ELISA法检测肺组织和BALF中肿瘤坏死因子-a (TNF-a)、白介素1β(IL-1β_、IL-6、IL-10和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattratctant protein-1, MCP-1)的浓度。结果与sham组比较,HVT组肺泡组织结构发生明显改变,肺损伤评分明显升高(P<0.05),动脉血氧分压(Pa02)明显降低(P<0.05),肺组织W/D明显升高(P<0.05),肺组织MPO活性明显升高(P<0.05),BALF中细胞总数、中性粒细胞计数、单核/巨噬细胞计数均明显增高(P<0.05),肺组织及BALF中国家自然科学基金项目(30700784)资助TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和MCP-1均明显增高(P<0.05); BML (0.1)组各检测指标较HVT组无明显变化(P>0.05); BML (1)组Pa02较HVT组明显升高(P<0.05),肺组织及BALF中IL-10较HVT组无明显变化(P>0.05),其它检测指标均较HVT组明显降低(P<0.05)；BOC+BML (1)组Pa02较BML(1)组明显降低(P<0.05),肺组织及BALF中IL-10较BML(1)组无明显变化(P>0.05),其它检测指标均较BML(1)组明显升高(P<0.05)。结论BML-111(lmg/kg)干预可以改善大鼠机械通气肺损伤时肺组织的病变程度,抑制中性粒细胞浸润,降低肺组织促炎介质的产生和渗出。BML-111可以减轻机械通气肺损伤时肺部的炎症反应,对大鼠机械通气肺损伤具有一定的保护作用。第二部分脂氧素受体激动剂BML-111对大鼠机械通气肺损伤NF-κB和MAPK/AP-1信号通路的影响目的探讨BML-111是否通过抑制核因子-κB (nuclear factor-kappaB, NF-κB)和丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)/激活蛋白-1(activator protein-1, AP-1)两个信号通路,减轻大鼠机械通气肺损伤时肺部的炎症反应,发挥对机械通气肺损伤的保护作用。方法SPF级雄性SD大鼠32只,6-8周龄,体重200-250g,随机分为四组(n=8)：(1)小潮气量机械通气组(LVT)：潮气量6m1/kg；(2)大潮气量机械通气组(HVT)：潮气量20ml/kg;(3) lmg/kg BML-111干预组(BML(1))：潮气量20ml/kg,机械通气开始时腹腔注射BML-111(1mg/kg);(4) BOC-2加BML-111干预组(BOC+BML (1)),潮气量20m1/kg,机械通气开始前30min腹腔注射BOC-2(50μg/kg),机械通气开时腹腔注射BML-111(lmg/kg)。机械通气各组呼吸频率均为80次/分,机械通气时间均为4h。Western blotting肺组织胞浆蛋白中NF-κB和核因子κB抑制因子(inhibitor of kappaB,IκB-a)表达水平,肺组织胞核蛋白中NF-κB的表达水平,肺组织总蛋白中细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulatedprotein knases,ERK).p38MAPK以及c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)的表达及其磷酸化水平采用Western blotting法进行检测。肺组织中AP-1及转录因子NF-κB结合DNA的活性通过凝胶电泳迁移实验(electrophoretic mobility shift assays,EMSA)进行检测。结果HVT组大鼠肺组织胞浆蛋白中NF-κB和IκB-α蛋白表达水平较LVT组明显降低(p<0.05),胞核蛋白中NF-κB表达明显升高(p<0.05)；BML(1)组NF-κB和IκB-α在大鼠肺组织胞浆蛋白中的表达水平较HVT组明显升高(p<0.05),胞核蛋白中NF-κB表达较HVT组明显降低(p<0.05)；BOC+BML(1)组大鼠肺组织胞浆蛋白中NF-κB和IκB-α的表达水平较BML(1)组明显降低(p<0.05)。各组大鼠肺组织总蛋白中ERK.p38MAPK和JNK蛋白表达均没有差异。与LVT组比较,HVT组ERK.p38MAPK和JNK蛋白磷酸化水平均明显增高(p<0.05)；BML(1)组ERK.p38MAPK和JNK磷酸化水平较HVT组明显降低(p<0.05)；BOC+BML(1)组ERK.p38MAPK和JNK蛋白磷酸化水平较BML(1)组明显增高(P<0.05)。EMSA结果显示：与LVT组比较,HVT组大鼠肺组织中NF-κB和AP-1的DNA结合活性明显增强；BML(1)组肺组织中NF-κB和AP-1的DNA结合活性较HVT组明显减弱；BOC+BML(1)组肺组织中NF-κB和AP-1的DNA结合活性较BML(1)组明显增强。结论BML-111增强了机械通气肺损伤时胞浆蛋白中IκB-α表达,抑制了NF-κB核转位,减弱了ERK.p38MAPK和JNK的磷酸化,降低了转录因子NF-κB和AP-1的DNA结合活性。说明BML-111对机械通气肺损伤的保护作用至少部分是通过抑制NF-κB和MAPK/AP-1信号转导通路实现的.第三部分脂氧素受体激动剂BML-111通过促进中性粒细胞凋亡加速大鼠机械通气肺损伤时肺部炎症的消退目的探讨BML-111对大鼠机械通气肺损伤时肺部炎症消退的影响及其机制。方法实验分为两部分。第一部分探讨BML-111是否能加速大鼠机械通气肺损伤时肺部炎症的消退。104只SPF级雄性SD大鼠随机分为二组：机械通气肺损伤组(VILI)和机械通气肺损伤+BML-111干预组(BML-111)。VILI组分别于机械通气后0h、6h、12h、24h、48h、3d、4d和7d放血处死大鼠,每个时间点8只。BML-111组于机械通气结束后12h给予lmg/kg BML-111腹腔注射,分别于机械通气后24h、48h、3d、4d和7d放血处死大鼠,每个时间点8只。光学显微镜下观察大鼠肺组织病理变化；测定大鼠肺组织湿／干重比(wet/dry weight ratio, W/D); BCA法检测支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中的总蛋白浓度；对BALF中细胞进行分类计数；ELISA法检测BALF中肿瘤坏死因子-a (TNF-a).白介素1β(IL-1β)、IL-6和IL-10的浓度。第二部分探讨BML-111是否通过促进中性粒细胞凋亡加速机械通气肺损伤时肺部炎症的消退。40只SPF级雄性SD大鼠随机分为五组：假手术组(sham),只进行经口气管插管,保留自主呼吸；机械通气肺损伤组(VILI),潮气量20ml/kg;机械通气肺损伤+BML-111干预组(BML-111),潮气量20ml/kg,机械通气结束12h时腹腔注射BML-111(lmg/kg)；机械通气肺损伤+caspase广谱抑制剂z-VAD-fink组(z-VAD),潮气量20ml/kg,机械通气结束时腹腔注射z-VAD-fink (10μg/kg),分别于4h后和8h后各追加一次z-VAD-fink (10μg/kg);机械通气肺损伤+BML-111干预+caspase广谱抑制剂组(z-VAD-BML),潮气量20ml/kg,机械通气结束12h时腹腔注射BML-111(lmg/kg);机械通气结束时腹腔注射z-VAD-fink (10μg/kg),分别于4h后和8h后各追加一次z-VAD-fink (10μg/kg)。行机械通气的各组,机械通气时间均为1h。于第二天查动脉血气分析,放血处死大鼠,流式细胞术检测BALF中中性粒细胞凋亡的比例。观察大鼠肺组织病理学改变并进行肺损伤评分,测定小鼠肺组织W/D, BALF细胞分类计数,BALF中蛋白含量采用BCA法进行测定；BALF中白介素1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子-a (TNF-a)的浓度用ELISA法检测。结果第一部分结果显示机械通气后大鼠肺组织损伤及炎症反应逐渐加重,于12h达到高峰。12h后肺损伤及肺部炎症反应逐渐减轻,至第3天基本恢复正常。在炎症高峰期(12h)给予BML-111干预明显加速了肺损伤的修复及肺部炎症反应的消退。肺部炎症在第2天基本恢复正常。第二部分结果显示BML-111能促进BALF中中性粒细胞凋亡。同时,BML-111能减轻肺组织病理损伤,减少中性粒细胞浸润,降低BALF中促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量,促进抗炎因子IL-10的产生。caspase广谱抑制剂z-VAD-fink可明显抑制中性粒细胞凋亡,抑制了BML-111对机械通气肺损伤的保护作用。结论BML-111干预明显的促进了VILI时BALF中中性粒细胞的凋亡,加速了肺部炎症的消退,而caspase广谱抑制剂z-VAD-fmk可明显减弱BML-111促进中性粒细胞凋亡的作用并且抑制了BML-111对机械通气肺损伤的保护作用,说明BML-111加速肺部炎症消退的作用是通过促进中性粒细胞凋亡实现的。