绿色木霉菌黄色素的发酵优化、提取分离及结构鉴定

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本文以绿色木霉菌(Trichoderma viride)为试验菌株,首先对其所产生的黄色素进行发酵动力学特征的研究,然后对绿色木霉菌进行定向培养使其产生更多的黄色素,在最优培养基组成及发酵条件下对黄色素发酵液进行提取、分离和物质鉴定,得出绿色木霉菌黄色素5个组分物质组成结构,为开发一种新型的微生物代谢产生的天然色素提供研究依据。本文的主要研究成果如下:1、绿色木霉菌(T. viride)黄色素发酵液不同稀释倍数的溶液在290nm及380nm处有最大吸收峰,该黄色素最大吸收波长与已有较多报道的红曲黄色素的最大吸收波长(370、388nm)相近。在T. viride产黄色素的液态发酵过程中,通过测定菌体干重、吸光值(色价)、残糖浓度和pH值,得到T. viride液态发酵过程中菌体生长、黄色素合成和底物消耗的动力学参数变化曲线。从发酵过程曲线可以得出绿色木霉菌体生长和黄色素的合成属于部分生长偶联型。2、在培养基碳源、氮源组成,装液量及摇床转速、接种量、培养时间及培养温度等单因素实验的基础上,采用Box-Behnken设计及响应面分析法优化T. viride产天然黄色素的培养基组成和发酵工艺条件。结果表明,在试验范围内,T. viride产黄色素的优化培养条件为:马铃薯液态培养基(250g·L-1马铃薯浸汁,2g·L-1Na2HPO4),外加碳源选择21.7g·L-1木糖,摇瓶装液量为50mL/250mL,培养温度35℃,接种量6%(v/v),摇床转速120r·min-1,培养时间152h。在优化培养条件下发酵液黄色素的色价为52.8±0.8U·mL-1。马铃薯培养基中添加尿素、硫酸铵、蛋白胨、牛肉浸粉等氮源会抑制黄色素的生成。3、利用薄层层析与红外及紫外光谱联用的方法快速、高效地获得了绿色木霉菌黄色素物质成分的主要信息。通过对红外光谱谱图解析可知,三个色素成分谱图曲线大致相同,每个物质又有不同的吸收谱带,黄色素物质中出现了羟基、氨基、甲基、亚甲基、羧基及烯键、炔键、苷键、酯键的特征峰,各物质又不同程度地含有芳香骨架,其在紫外扫描光谱中也得到了印证。由此可知色素物质含有的官能团较多,结构比较复杂。在紫外光谱扫描中,三个明显的紫外吸收峰位置及强度表明了该类色素物质为含有由少到多环的芳香烃类物质,其中成分b、c两者都是稠环芳烃,可能是萘、蒽、菲等并各自有不同的取代基及官能团。4、通过对绿色木霉菌的黄色素及代谢物的溶剂提取及分步萃取,及正相柱层析、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析和高效液相色谱(HPLC)的分离方法,应用电子喷雾质谱(ESI-MS),1H-1H COSY,13C-1H COSY,HMBC和NOESY在内的一维和二维核磁共振技术进行鉴定,共得到5个纯品化合物。分别为:化合物E1-2、2,4-已二烯酸、Viridenepoxydiol、Sorbiquinol、Vertinolide。其中E1-2为从未报道的新化合物,且E1-2、Sorbiquinol、Vertinolide均为首次从T. viride中分离出。
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