第一部分核仁素和bcl-2在骨肉瘤细胞株中的表达目的1.选择p53野生型人骨肉瘤细胞株U-2OS、p53变异型人骨肉瘤细胞株MG-63和p53缺失型人骨肉瘤细胞株Saos-2,并选择永生化人成骨细胞hFOB1.19(人SV40转染成骨细胞)作为正常对照,定性了解上述细胞正常情况下核仁素和bcl-2的表达情况,并利用MTT实验研究顺铂对上述骨肉瘤细胞株的增值抑制作用。方法取指数生长期的U-2OS、MG-63、Saos-2和hFOB1.19,提取总RNA,逆转录得到cDNA,分别设计针对核仁素、bcl-2和内参GAPDH的PCR引物,进行PCR检测核仁素和bcl-2在人成骨肉瘤中的基因表达；分别提取细胞总蛋白,胞蛋白,利用免疫印迹法(Western blotting)检测细胞中核仁素和bcl-2蛋白表达水平；利用MTT,检测顺铂对不同P53功能状态的骨肉瘤细胞凋亡抑制作用。结果免疫印迹法(Western blotting)和RT-PCR结果显示,在骨肉瘤细胞株U-2OS、MG-63、Saos-2和正常人成骨细胞hFOB1.19中,均检测到了核仁素和bcl-2基因和蛋白的表达。与正常人成骨细胞hFOB1.19相比较,U-2OS、MG-63和Saos-2的核仁素和bcl-2基因和蛋白表达水平均显著增高。顺铂对不同骨肉瘤细胞株均有明显的抑制作用,并且可能和核仁素的表达水平相关。结论不同P53突变状态的骨肉瘤细胞系与成骨细胞比较,核仁素过表达的同时伴随bcl-2过表达。顺铂对不同骨肉瘤细胞株增值抑制作用可能与核仁素的表达水平相关。既初步验证了我们试验条件的可行性,又为进一步的研究打下了基础：我们可以进一步研究P53不同功能状态下,使用反义核仁素寡核苷酸对顺铂诱导的化疗敏感性的影响及进一步用RNA-CHIP等实验研究核仁素和bcl-2之间的相互作用,为进一步研究核仁素在骨肉瘤凋亡中的作用打下基础。第二部分反义核仁素寡核苷酸以P53非依赖机制增强人骨肉瘤细胞顺铂化疗敏感性目的观察核仁素反义寡核苷酸转染对顺铂诱导人骨肉瘤细胞株化疗敏感性影响方法设计合成核仁素反义与随机寡核苷酸并转染骨肉瘤细胞株Saos-2、U2-OS和MG63,利用细胞免疫组化和’Western Blot检测核仁素反义寡核苷酸转染有效性；将每种骨肉瘤细胞分别随机分为六组：空白对照组、单纯用顺铂组、转染随机核仁素寡核苷酸组、转染随机核仁素寡核苷酸后再用顺铂组、转染反义核仁素寡核苷酸组和转染反义寡核苷酸后再用顺铂组；用MTT法分别检测各组骨肉瘤细胞的增殖抑制率,并用Western Blot和RT-PCR检测各组核仁素和Bcl-2蛋白及其mRNA表达的表达情况；用Hoechst33258染色方法检测各组骨肉瘤细胞凋亡形态学改变及凋亡率；用流式细胞术检测各组骨肉瘤细胞凋亡率；通过检测各组骨肉瘤细胞caspase-3活性进一步反映骨肉瘤细胞凋亡情况。结果细胞免疫组化和Western Blot检测显示核仁素反义寡核苷酸有效地下调核仁素、bcl-2基因和蛋白表达；MTT、Western Blot、RT-PCR、Hoechst33258染色、流式细胞术和caspase-3活性检测显示反义核仁素寡核苷酸有效地促进了顺铂诱导的各种P53功能状态骨肉瘤细胞的凋亡；结论反义核仁素寡核苷酸以P53非依赖机制增强人骨肉瘤细胞顺铂化疗敏感性。第三部分骨肉瘤细胞核仁素过表达增加bcl-2mRNA稳定性目的了解骨肉瘤细胞株中核仁素过表达与bcl-2mRNA稳定性之间的关系；方法结合放线菌素d研究不同骨肉瘤细胞株中bcl-2mRNA稳定性差别；利用RNA-CHIP技术研究不同骨肉瘤细胞株中核仁素与bcl-2mRNA的结合作用；利用脂质体转染技术,研究反义下调核仁素对骨肉瘤细胞bcl-2mRNA稳定性及核仁素与bcl-2mRNA的结合作用的影响；结果核仁素的表达水平影响骨肉瘤细胞bcl-2mRNA稳定性相关,核仁素表达越高,bcl-2mRNA稳定性越强；骨肉瘤细胞中核仁素和bcl-2mRNA相结合,结合作用与核仁素的表达相关；反义下调核仁素的表达,可以降低bcl-2mRNA稳定性和降低核仁素和bcl-2mRNA的结合作用。结论骨肉瘤细胞核仁素过表达增加bcl-2mRNA稳定性