萜类酶的产物不专一性在萜类酶中十分常见,并与倍半萜类天然产物的多样性相关。对其突变型研究常常产生与野生型酶不一样的产物分布结果,甚至出现新的产物。这与蛋白质工程中,通过设计改造蛋白,增强催化活性或获得新的催化功能相契合,引起了科学家对研究萜类酶特别是萜类酶的突变体的兴趣。在本文中,我们选取了有代表性的倍半萜合酶Trichodiene合酶(TDS)作为研究对象,采用计算模拟的方法对其主副产物的产生机制及关键残基对酶催化影响机制进行探索。通过双层(dual-level)QM/MM模拟方法和密度泛函理论分别对TDS催化机制和气相中反应机理进行了理论计算。选用了三环副产物α-barbatene作为对照,与产生两环主产物trichodiene反应机理进行比较,探究TDS对主副产物的化学选择根源。研究表明TDS对于这两种产物的关键选择分歧点在于中间体cuprenyl cation,反应过程中关键步骤发生不同的甲基的转移。合成trichodiene路径中转移竖直C12甲基,在酶体系中需要跨越8.19 kcal/mol能垒,气相反应经历4.6 kcal/mol能垒。而TDS催化合成α-barbatene路径中转移竖直C13甲基的自由能能垒为10.11kcal/mol,气相中能垒为5.36 kcal/mol,之后产生同位甲基的结构并能形成第三个环。五元环上竖直C12甲基到竖直C13甲基的转变需要跨过2.90 kcal/mol能垒,相对于甲基转移需要经历的高能垒,五元环构象在酶体系中能够十分轻松的互相转换。可以确定在TDS中执行C12甲基转移更为有利,即对于主产物trichodiene有更多的选择性。为了寻找TDS活性中心控制反应选择性的关键可能残基,设计了T96I、T96S和T96V三个突变型TDS,发现相较于野生型TDS,三个突变型的酶催化反应自由能能垒都有一定程度的差异。特别是T96V和T96I对C13甲基转移的能垒相对增加更多,这可能降低α-barbatene的产率。究其原因,主要由于亲水性残基苏氨酸到疏水残基缬氨酸/异亮氨酸的转变以及推电子基团羟基的消失导致。T96S仅改变了羟基的位置,导致两种甲基转移过程能垒都增加。萜类酶中活性位点附近的一些非酸/碱性氨基酸,例如羟基类残基,对于催化过程也有影响,在突变设计中需要更多的关注。这种有目的性的针对关键反应步骤的定点突变,能够快速帮助缩小定位关键残基范围,希望这种新的思路能对蛋白质设计工程的研究工作者产生启发。