论文部分内容阅读
第一部分大鼠靶向α7nAchR基因shRNA真核表达载体的构建及重组腺病毒制作目的构建大鼠烟碱样乙酰胆碱受体α7亚型(α7nAchR)基因短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,并筛选制作出具有α7nAchR基因表达干扰效果的重组腺病毒。方法在Genebank中查找大鼠α7nAchR基因全序列,根据siRNA的设计原则,设计并合成编码α7nAchR基因shRNA的DNA模板引物AY318、AY587、 AY4444+559.AY318+857,分别与线性化的质粒载体pGenesil-1.1、pGenesil-1.4、 pGenesil-1.2,pGenesil-1.3连接,以分别构建编码1条α7nAchR基因shRNA和编码2条α7nAchR基因shRNA的重组质粒载体；重组质粒载体感染感受态的DH5a细胞,并用含卡那霉素的LB培养基培养过夜；提取细菌质粒进行特定酶切,并用1%的琼脂糖凝胶电泳,根据电泳图的DNA片段大小鉴定重组质粒是否构建成功：用LR体外同源重组法将AY318,AY444+559,AY 857shRNA表达框分别从重组质粒pGenesil转移至腺病毒pGSadeno质粒表达载体上,构建重组腺病毒质粒；用相同的方法感染DH5a细胞,并用XbaI进行单酶切,收集酶切产物,并用1%琼脂糖凝胶进行电泳,根据电泳图鉴定重组腺病毒pGSadeno质粒是否构建成功；提取线性化的重组腺病毒DNA并转染HEK293细胞,经放大培养获得所需滴度的重组腺病毒上清;将重组腺病毒感染GH3细胞,分为正常对照组、重组腺病毒HK对照组、重组腺病毒AY318 shRNA组、重组腺病毒AY857 shRNA组、重组腺病毒AY444+559 shRNA组,提取RNA进行PCR反应,根据α7nAchR基因的表达情况,选择具有最佳基因干扰效果的重组腺病毒。结果限制性内切酶SacI酶切重组质粒pGenesil-1.1-AY318、pGenesil-1.4-AY857,分别出现2条约1000bp和700bp的DNA片段,说明重组质粒编码成功；限制性内切酶HindⅢ和EcoRI双酶切重组质粒载体pGenesil-1.3-AY318+857和pGenesil-1.2-AY444+559,出现一条约700bp的DNA条带,表明重组质粒编码成功：XbaI单酶切重组腺病毒质粒载体pGSadeno-AY444+559, AY318, AY 857 shRNA,出现一条约2.5Kb的DNA条带,说明重组腺病毒成功;重组腺病毒感染GH3细胞,荧光显微镜下有绿色荧光蛋白表达,说明重组腺病毒具有感染力;重组腺病毒感染GH3细胞,与正常对照组比较,α7nAchR基因表达在重组腺病毒HK对照组无明显变化,而在重组腺病毒AY318 shRNA组、重组腺病毒AY857shRNA组、重组腺病毒AY444+559 shRNA组均显著下降,其中以重组腺病毒AY857 shRNA组下降最明显。结论具有感染力和干扰α7nAchR基因表达的重组腺病毒质粒载体构建成功,且pGSadeno-AY857 shRNA具有最强的基因干扰效果。第二部分小檗碱通过a7nAchR胆碱能抗炎通路改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的分子机制目的探讨小檗碱是否通过a7nAchR胆碱能抗炎通路(CAP)发挥改善2型糖尿病(T2DM)大鼠胰岛素抵抗的作用。方法Wistar雄性大鼠SPF级饲养,采用高糖高脂饲料和小剂量链脲佐菌素(STZ)尾静脉注射建立大鼠T2DM模型,动物随机分为模型组、小檗碱组、烟碱组、二甲双胍组、另设正常对照组；同一批次另一部分T2DM大鼠通过尾静脉注射小剂量a7nAchR基因干扰重组腺病毒,建立a7nAchR基因沉默的T2DM大鼠模型,并随机分为T2DM+空白腺病毒组、T2DM+重组腺病毒组、T2DM+重组腺病毒+小檗碱组,另设T2DM对照组、正常对照组。用相应的干预措施治疗6周后,处死动物。氧化酶法检测各组血清总胆碱酯酶(TCHE)活性,乙酰胆碱(Ach)水平,空腹血糖(FPG)水平；ELISA法测血清空腹胰岛素(FINS),肿瘤坏死因子α(TNF-α),白介素1β (IL-1β)和白介素6(IL-6)：免疫组化法检测肝组织a7nAchR蛋白的表达,并分析阳性区域的平均光密度值(MOD)；蛋白质免疫印迹法(Western-blot)检测肝组织的核转录因子κB (NF-κB p65),磷酸肌醇-3激酶(PI-3K),胰岛素受体底物1(IRS-1),丝氨酸307位磷酸化胰岛素受体底物1(IRS-1 ser307),葡萄糖转运子2(Glut2),脂肪组织的葡萄糖转运子4(Glut4)蛋白的表达；实时定量PCR法(RT-PCR)检测肝组织和骨骼肌组织的α7nAchR、胰岛素受体(IR)、IRS-1的mRNA及骨骼肌组织的Glut4 mRNA表达。结果与正常组比较,模型组大鼠体重显著降低,FPG、FINS、HOMA-IR明显升高(P<0.01);血清TCHE活性明显升高,Ach水平明显下降(P<0.01);血清IL-1β、NF-α水平均显著升高(P<0.01),而IL-6水平无明显变化;肝组织NF-κBp65和a7nAchR蛋白表达显著升高,pIRS-1 ser307与IRS-1的比值(pIRS-1 ser307/IRS-l)升高,而肝组织PI-3K p85、GLUT2蛋白表达明显下降(P<0.01),脂肪组织GLUT4蛋白下降(P<0.05);肝组织和骨骼肌组织IR、IRS-1 mRNA和骨骼肌组织GLUT4 mRNA的表达均显著下降(P<0.01),骨骼肌组织a7nAchR mRNA表达上调(P<0.05)。与模型组比较,小檗碱组大鼠体重无明显变化,FPG、FINS、HOMA-IR均显著下降(P<0.01)：血清TCHE活性下降,而Ach水平升高(P<0.05,P<0.01)；血清IL-1β水平下降(P<0.01),而IL-6水平无明显变化;肝组织NF-κB p65蛋白的表达减少,pIRS-1 ser307/IRS-1比值下降(P<0.05,P<0.01);肝组织PI-3K p85、GLUT2和α7nAchR蛋白表达增加,脂肪组织GLUT4蛋白表达增加(P<0.01)：肝组织中IR、IRS-1和α7nAchR mRNA,骨骼肌组织IRS-1、α7nAchR和GLUT4 mRNA的表达均有不同程度升高(P<0.05,P<0.01)。在重组腺病毒a7nAchR基因沉默的大鼠中,与正常组比较,其余各组大鼠体重显著下降,FPG、FINS、HOMA-IR均显著上升(P<0.05,P<0.01)；各组血清中的TCHE活性不同程度升高,Ach水平下降(P<0.05,P<0.01),而T2DM+重组腺病毒+小檗碱组无明显差异；血清IL-1β、TNF-α水平均升高(P<0.05,P<0.01),而IL-6无明显变化;肝组织NF-κB p65蛋白表达增加,pIRS-1ser307/IRS-1比值升高,PI-3K p85、GLUT2蛋白表达下降,脂肪组织GLUT4蛋白表达下降(P<0.05,P<0.01)；肝组织和骨骼肌组织IR、IRS-1 mRNA、骨骼肌组织GLUT4 mRNA表达均显著下降(P<0.05,P<0.01)；肝组织a7nAchR蛋白在T2DM对照组和T2DM+空白腺病毒组显著上调(P<0.01),而在T2DM+重组腺病毒组和T2DM+重组腺病毒组+小檗碱组下调(P<0.05)；肝组织和骨骼肌组织a7nAchR mRNA在T2DM对照组与T2DM+空白腺病毒组表达上调(P<0.05,P<0.01)。与T2DM组和T2DM+空白腺病毒组比,T2DM+重组腺病毒组和T2DM+重组腺病毒+小檗碱组肝组织a7nAchR mRNA和蛋白表达水平下降(P<0.05,P<0.01),骨骼肌组织a7nAchR mRNA表达水平显著下降(P<0.01);T2DM+重组腺病毒+小檗碱组TCHE活性下降(P<0.05)、Ach水平升高(P<0.01),余各指标无显著差异。与T2DM+重组腺病毒组比,T2DM+重组腺病毒+小檗碱组TCHE活性显著下降,Ach水平显著上升(P<0.05),余各指标无显著性差异。结论1.实验成功建立了T2DM胰岛素抵抗大鼠模型和α7nAchR基因沉默的T2DM大鼠模型。2.小檗碱可以抑制T2DM和α7nAchR基因沉默的T2DM大鼠胆碱酯酶活性,增加Ach浓度；小檗碱可以降低T2DM大鼠血清炎症因子水平,促进α7nAchR蛋白和mRNA的表达,并下调炎症信号转录因子NF-κB p65蛋白表达,而α7nAchR基因沉默后不能下调NF-κB p65蛋白和血清炎症因子,说明小檗碱可能通过α7nAchR相关的CAP (Ach-α7nAchR-JAK/STAT-NF-κB)改善T2DM大鼠炎症反应。3.小檗碱能够改善T2DM大鼠胰岛素传递信号通路IR/IRS-1-PI3K/AKT-GLUT相关因子的蛋白和mRNA表达,促进胰岛素信号转导,改善胰岛素抵抗,而在α7nAchR基因沉默的T2DM大鼠中却不能改善胰岛素抵抗,说明α7nAchR与胰岛素抵抗密切相关。4.小檗碱激活T2DM大鼠CAP,减轻炎症反应,改善糖代谢紊乱和胰岛素抵抗；而小檗碱对α7nAchR基因沉默的T2DM大鼠的炎症反应、糖代谢紊乱和胰岛素抵抗均不能明显改善。说明小檗碱可能通过激活α7nAchR相关的胆碱能抗炎通路(Ach-α7nAchR-JAK/STAT-NF-κB)改善T2DM大鼠胰岛素抵抗。