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背景瘢痕疙瘩是一种以成纤维细胞过度增殖和胶原为主的细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)成分过度沉积为主要病理特征的皮肤纤维增生性疾病,其确切发病机制仍不清楚,目前尚无理想的治疗方法。因而,阐明瘢痕疙瘩的分子发病机理,针对其发病机制的特异性靶点研究和开发治疗瘢痕疙瘩的新药已成为迫切需要。转化生长因子-1(Transforming growth factor beta-1, TGF-β1)被认为是瘢痕疙瘩中最关键的促纤维化细胞因子,TGF-β1主要通过下游的Smads家族传递信号,研究表明TGF-β/Smad信号途径在瘢痕疙瘩发病机制中发挥关键作用。本课题组前期通过体内外实验证明,复方芪参提取物(Compound Astragalus andSalvia miltiorrhiza extract, CASE)通过干扰TGF-β/Smad信号途径,在大鼠慢性损伤肝脏中发挥抗肝纤维化作用,并抑制肝癌HepG2细胞的侵袭。目前,我们已经研究表明,CASE可显著抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、胶原合成及侵袭;本课题拟继续研究CASE对瘢痕疙瘩成纤维细胞移行能力的影响,进一步证明其抗瘢痕疙瘩作用;并深入探讨CASE对瘢痕疙瘩成纤维细胞内TGF-β/Smad信号转导途径的影响,以阐明其抗瘢痕疙瘩作用机制。此外,除了Smad信号,TGF-β1还可以激活丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase, MAPK)信号通路,主要包括细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase, ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)和p38激酶三个亚族。我们前期已经阐述了瘢痕疙瘩成纤维细胞内MAPK通路调控TGF-β1诱导Smad3信号转导及靶基因纤溶酶原激活物抑制剂-1(Plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)转录活性的机制;在此基础上,本课题继续研究MAPK通路对TGF-β/Smad信号转导其他重要环节的调控作用,并进一步探讨CASE通过调控MAPK通路的抗瘢痕疙瘩作用机制。目的1.在前期研究已经证明CASE抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、胶原合成及侵袭的基础上,继续观察CASE对瘢痕疙瘩成纤维细胞移行能力的影响,以进一步证明其抗瘢痕疙瘩作用;2.为了阐明CASE抗瘢痕疙瘩的分子机制,研究CASE对瘢痕疙瘩成纤维细胞内TGF-β/Smad信号转导途径的影响;3.在阐述MAPK通路调控TGF-β/Smad信号转导机制的基础上,进一步探讨CASE通过调控MAPK通路的抗瘢痕疙瘩作用机制。方法1.细胞培养与处理瘢痕疙瘩成纤维细胞在无血清培养基培养24h,加或不加CASE(7.5,15,30mg L-1)处理,或者加或不加三种MAPK抑制因子(ERK抑制因子PD98059、JNK抑制因子SP600125、p38抑制因子SB203580)共孵育5h;随后根据不同实验,加入不同浓度的TGF-1刺激不同时间;对照组细胞加入等量溶媒。本研究中各实验至少重复三次。2.体外细胞划痕实验观察瘢痕疙瘩成纤维细胞的移行能力瘢痕疙瘩成纤维细胞铺满单层后,进行划痕损伤,分别于损伤后0,12,24h,在显微镜下拍照,观察细胞移行情况;以正常皮肤成纤维细胞作为对照。3.免疫沉淀与western blot法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞内Smad2/3磷酸化以及Smad2/3/4复合物的表达培养结束后提取瘢痕疙瘩成纤维细胞总蛋白,细胞提取物中加入抗-Smad2/3抗体进行免疫沉淀,随后分别利用针对Smad2/3C-末端(C-terminallyphosphorylated Smad2/3; pSmad2C, pSmad3C)和连接区(Linker-phosphorylatedSmad2/3; pSmad2L, pSmad3L)磷酸化位点的特异性抗体:抗-pSmad2C (Ser465/467)、抗-pSmad2L (Ser249/254)、抗-pSmad3C (Ser423/425)、抗-pSmad3L(Ser208/213),检测细胞内Smad2/3C-末端和连接区磷酸化水平;并利用抗-Smad4抗体检测与Smad2/3结合的Smad4,即Smad2/3/4复合物;以细胞内Smad2/3蛋白和细胞提取物中的Smad4蛋白作为参照。4.细胞免疫荧光染色法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞内磷酸化Smad2/3及MAPKs蛋白的细胞内定位表达瘢痕疙瘩成纤维细胞接种于24孔板内的无菌玻片上,培养结束后取出细胞玻片进行固定、封闭,分别与相应的抗体孵育过夜,然后再与荧光标记的二抗孵育,在荧光显微镜下观察磷酸化Smad2/3以及MAPKs蛋白的细胞内定位表达并拍照。5.Western blot法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞内Smad7和PAI-1及MAPKs蛋白表达培养结束后提取瘢痕疙瘩成纤维细胞总蛋白,采用western blot法检测细胞内Smad7或PAI-1蛋白表达水平,以GAPDH为内参;检测细胞内pERK1/2, pJNK1/2,pp38表达,以非磷酸化ERK1/2, JNK1/2, pp38为参照。6.实时定量RT-PCR法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞内PAI-1mRNA水平培养结束后提取瘢痕疙瘩成纤维细胞总RNA,逆转录为cDNA,分别利用各自引物进行靶基因PAI-1及内参基因β-actin的SYBR Green I实时定量PCR反应,利用循环阈值(Threshold cycles, CT)计算PAI-1mRNA的相对表达量,以管家基因β-actin为内参;根据融解曲线确定扩增反应特异性。结果1. CASE显著抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的移行瘢痕疙瘩成纤维细胞在划痕损伤后,愈合速度比正常皮肤成纤维细胞更快,而且对TGF-β1的刺激更为敏感;CASE呈浓度依赖性显著抑制TGF-β1诱导的瘢痕疙瘩成纤维细胞移行,在30mg L-1浓度上细胞移行基本被完全抑制;相反,与溶媒对照相比,TGF-β1和CASE对正常皮肤成纤维细胞移行均无明显影响。2. CASE干扰瘢痕疙瘩成纤维细胞内TGF-β/Smad信号转导途径2.1CASE抑制Smad2/3C-末端和连接区磷酸化TGF-β1同时诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞内Smad2/3C-末端(pSmad2C,pSmad3C)和连接区(pSmad2L, pSmad3L)显著磷酸化,CASE明显抑制TGF-β1诱导的pSmad2L, pSmad3L的表达,而对pSmad2C, pSmad3C表达的抑制作用相对较弱,其中对pSmad2L和pSmad3C的抑制作用具有浓度依赖性。2.2CASE抑制Smad2/3/4复合物形成TGF-β1刺激导致瘢痕疙瘩成纤维细胞内Smad2/3/4复合物形成,CASE呈浓度依赖性显著抑制Smad2/3/4复合物表达,在15,30mg L-1浓度上几乎完全阻断复合物形成。2.3CASE阻断磷酸化Smad2/3转位入核在TGF-β1刺激下,pSmad2C, pSmad3C荧光强度中度增加,主要在胞核内表达,pSmad2L, pSmad3L荧光显著增强,在胞核及胞质中均有表达;CASE不仅显著抑制磷酸化Smad2/3的荧光强度,而且阻断其核内转位。2.4CASE上调Smad7蛋白水平TGF-β1刺激导致瘢痕疙瘩成纤维细胞内Smad7蛋白水平降低,CASE呈浓度依赖性增加Smad7蛋白表达,在30mg L-1浓度上,恢复至相当于对照组的水平(无TGF-β1刺激)。2.5CASE降低靶基因PAI-1mRNA和蛋白水平TGF-β1诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞内PAI-1mRNA水平明显升高,CASE呈浓度依赖性抑制PAI-1的转录活性,在15,30mg L-1浓度上达到统计学显著差异;同样,CASE在15,30mg L-1浓度上,几乎完全抑制了TGF-β1诱导的PAI-1蛋白表达。3.瘢痕疙瘩成纤维细胞内MAPK通路对TGF-β/Smad信号转导的调控作用前期研究中我们已经证明瘢痕疙瘩成纤维细胞内TGF-β1诱导Smad3信号转导及PAI-1转录活性受到MAPK通路调控:p38通路主要调控Smad3连接区磷酸化以及Smad2/3/4复合物形成,ERK与JNK通路负责调控磷酸化Smad3转位入核,最终ERK、JNK及p38通路均参与调控靶基因PAI-1转录活性。本研究继续探讨MAPK通路对TGF-β/Smad信号转导途径其他重要环节的调控作用,结果如下:3.1三种MAPK抑制因子对Smad2C-末端和连接区磷酸化的影响p38抑制因子(SB203580)几乎完全抑制了TGF-1诱导的pSmad2L表达,同时对pSmad2C表达也具有中度抑制作用。ERK抑制因子(PD98059)及JNK抑制因子(SP600125)对Smad2蛋白C-末端和连接区磷酸化的抑制作用不明显。3.2三种MAPK抑制因子对磷酸化Smad2转位入核的影响p38抑制因子(SB203580)明显降低pSmad2C及pSmad2L的荧光强度,并抑制其核内表达;而ERK抑制因子(PD98059)与JNK抑制因子(SP600125)对pSmad2C及pSmad2L的荧光强度没有明显影响,却能阻断两者转位入核。3.3三种MAPK抑制因子对Smad7蛋白水平的影响p38抑制因子(SB203580)能够逆转被TGF-β1抑制的Smad7蛋白表达,使其恢复至相当于对照组的水平(无TGF-β1刺激)。ERK抑制因子(PD98059)和JNK抑制因子(SP600125)有增加Smad7蛋白水平的趋势,但无统计学显著差异。3.4三种MAPK抑制因子对PAI-1蛋白水平的影响三种MAPK抑制因子均能明显抑制TGF-β1诱导的PAI-1蛋白表达,其中p38抑制因子(SB203580)的抑制作用最强。4CASE对瘢痕疙瘩成纤维细胞内MAPK信号通路的调控作用鉴于CASE的抗瘢痕疙瘩作用机制涉及TGF-β/Smad信号转导途径,而瘢痕疙瘩成纤维细胞内TGF-β/Smad信号转导又受到MAPK通路的调控,因而,我们进一步研究CASE对瘢痕疙瘩成纤维细胞内MAPK信号通路的调控作用,结果如下:4.1CASE对ERK,JNK及p38磷酸化的影响瘢痕疙瘩成纤维细胞内ERK、JNK和p38的基线磷酸化水平较高,TGF-β1刺激导致ERK、JNK和p38磷酸化水平进一步增强;CASE(7.5,15,30mg L-1)可降低瘢痕疙瘩成纤维细胞内ERK、JNK和p38的磷酸化水平,三个浓度组之间抑制作用相当。4.2CASE对磷酸化ERK,JNK及p38核内表达的影响瘢痕疙瘩成纤维细胞内基线磷酸化的ERK、JNK和p38主要在细胞质内表达,TGF-β1刺激后pERK、pJNK和pp38的荧光进一步增强,且核内表达增加;CASE不仅降低pERK、pJNK和pp38的荧光强度,而且还阻碍三者的核内转位。结论1. CASE不仅显著抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、胶原合成及侵袭(前期研究证明),而且明显抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的移行,表明该药具有明显的抗瘢痕疙瘩作用。2.根据结果2.12.5,CASE可明显抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞内TGF-β1诱导的Smad2/3磷酸化,尤其是连接区磷酸化,以及Smad2/3/4复合物形成、阻断磷酸化Smad2/3转位入核、上调Smad7蛋白表达、最终降低靶基因PAI-1mRNA和蛋白水平;提示CASE可能主要是通过干扰TGF-β/Smad信号转导途径,发挥其抗瘢痕疙瘩作用。3.根据结果3.13.4,p38抑制因子显著抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞内TGF-β1诱导的Smad2连接区磷酸化、并上调Smad7蛋白表达;ERK抑制因子与JNK抑制因子阻断磷酸化Smad2转位入核,三种MAPK抑制因子均可降低PAI-1蛋白水平。结合前期研究结果,表明p38通路主要调控Smad2/3连接区磷酸化与Smad2/3/4复合物形成以及Smad7表达;ERK和JNK通路则主要负责调控磷酸化Smad2/3的转位入核,提示ERK、JNK和p38通路均参与调控靶基因PAI-1的转录活性及蛋白表达。4.根据结果4.14.2,CASE可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞内ERK、JNK和p38的磷酸化水平,并阻断pERK、pJNK和pp38的核内表达,提示CASE对MAPK信号通路具有调控作用。鉴于瘢痕疙瘩成纤维细胞内TGF-β/Smad信号转导受到MAPK通路调控,因而CASE也可能通过调控MAPK通路间接影响TGF-β/Smad信号转导途径,从而发挥抗瘢痕疙瘩作用。总之,CASE显著抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、胶原合成以及侵袭与移行,表明该药具有明显的抗瘢痕疙瘩作用;CASE抗瘢痕疙瘩的作用机制,可能主要是干扰TGF-β/Smad信号转导途径,并可能通过调控MAPK通路间接影响TGF-β/Smad信号转导,经由不同途径、作用于多个靶点,共同发挥抗瘢痕疙瘩作用。