研究背景及目的： 肝细胞肝癌(简称肝癌)发病率位居人类恶性肿瘤的第5位，每年大约有100万新发病例，其中45﹪在中国大陆，每年约有11万人死于肝癌，位居恶性肿瘤死亡率的第2位，虽然肝切除术和肝移植有可能治愈肝癌，但大部分患者(约60﹪～80﹪)在临床诊断时已失去手术根治机会，根据2005年美国癌症协会调查资料显示，总体肝癌的5年生存率仅为8.3﹪。因此，迫切需要探索新的肝癌治疗方法来提高疗效。 基因-病毒治疗作为一种新的肿瘤治疗手段受到愈来愈多的关注，选择适当的靶向机制提高病毒载体体内转染率、保证抗癌基因正常表达和对肿瘤细胞杀伤的同时，对机体的正常细胞没有破坏性的影响，是基因-病毒治疗系统能否应用于临床的关键所在。 我们利用肿瘤的无限生长和缺氧微环境两大特性为双靶点，通过基因重组技术对腺病毒进行改造，采用了端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控腺病毒早期表达基因E1a，缺氧反应启动子(HRE)调控E1b，同时在E1a下游插入外源目的基因p53，构建出携带p53基因由人端粒酶逆转录酶启动子和缺氧反应启动子双调控减毒增殖型腺病毒CNHK500-p53，通过体外实验对CNHK500-p53的选择性杀伤肝癌细胞株的能力进行评估，进一步观察CNHK500-p53对裸鼠肝癌移植瘤的治疗效果，并对其抗癌机制进行初步探讨。 方法： 1.携带p53基因由人端粒酶逆转录酶启动子和缺氧反应启动子双调控减毒增殖型腺病毒(CNHK500-p53)的构建和制备利用基因重组技术构建由hTERT启动子调控E1a基因及缺氧反应启动子调控E16基因表达并携带p53基因的减毒增殖型腺病毒载体质粒pSG500-p53。将pSG500-p53与含有5型腺病毒载体右臂的质粒pBHGE3共转染293细胞，通过细胞内DNA同源重组获得新的重组病毒，PCR法对重组病毒DNA进行鉴定，重组正确的病毒命名为CNHK500-p53。病毒在293细胞中反复扩增到需要量，氯化铯梯度离心法纯化病毒，用TCID50方法测得重组腺病毒滴度达到2.0×10<'10>pfu/ml。冻存备用。 2.CNHK500-p53体外抗肿瘤实验CNHKS00-p53 E1A、E1B蛋白和p53表达的检测及定量分析：Western blot法检测CNHK500-p53对HepG2、Hep3B细胞和BJ细胞感染后病毒蛋白E1A、E1B及抑癌基因p53的表达，ELISA定量检测抑癌基因p53的表达。 病毒增殖实验：分别用不同腺病毒CNHK500-p53、CNHK500、WAd5感染不同来源的肿瘤细胞株和正常细胞株，观察不同时相(Oh、24h、48h、96h)的病毒增殖情况，50﹪组织培养感染剂量(50﹪TCID)法测定病毒滴度并计算出在各种细胞中的增殖倍数。观察它们在不同细胞间的增殖差异。 荧光显微镜镜检观察病毒增殖情况：将携带绿色荧光蛋白报告基因的腺病毒CNHK500-EGFP和Ad-EGFP分别转染正常细胞BJ及肿瘤细胞Bel-7402、HepG2，转染后第3、7、10天在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。 细胞病理效应(CPE)：依次将腺病毒CNHK500-p53、CNHK500、Ad-p53按不同MOI值(MOI=0.01、0.1、1、10、100)感染不同的肝癌细胞株和正常细胞株，观察和比较CNHK500-p53对各种细胞的杀伤效应。 病毒杀伤实验(MTT)：按不同的MOI值将CNHK500-p53感染肝癌细胞株HepG2、Bel-7402及正常细胞株BJ细胞，计算出IC50值(50﹪抑制强度所需的最小药物浓度)。检测病毒对各种细胞的杀伤效率，并分别与CNHK500、Ad-p53相比较。 3.CNHK500-p53治疗裸鼠移植瘤的动物实验瘤内注射CNHK500-p53治疗裸鼠HepG2移植瘤： 在Balb/C小鼠右侧肋腹部皮下建立HepG2移植瘤模型，随机将成瘤裸鼠分为四组，包括CNHK500-p53、CNHK500、Ad-p53三个治疗组和PBS缓冲液阴性对照组(n=9)，采用单盲对照方法进行试验，给药途径为直接瘤内注射，观察和比较各治疗组对肝癌生长的作用；取肿瘤标本常规病理观察各组肿瘤生长情况；透射电镜观察病毒在移植瘤中的增殖情况。结果统计分析采用非配对t检验。 结果： 1.所构建的重组病毒经PCR鉴定，证实重组正确，病毒纯化后命名为CNHK500-p53；经Western-Blot检测E1A、E1B和p53显示：E1A蛋白表达存在细胞差异性，在肿瘤细胞(HepG2、Hep3B)中可检测到腺病毒早期蛋白E1A的表达，而在正常细胞中(BJ)中则难以检测到E1A的表达；重组病毒CNHK500-p53的E1B蛋白表达受到氧浓度条件的限制，当肝癌细胞株Hep3B、HepG2在MOI=1时感染CNHK500-p53，在常氧状态下(21﹪O<,2>)难以检测到E1B的表达，而在相同MOI值，对感染CNHK500-p53的细胞进行缺氧(<1﹪02)处理，可明显检测到E1B蛋白的表达，而感染CNHK500-p53的正常细胞无论常氧还是缺氧状态都难以检测到E1B蛋白的表达。在CNHK500-p53和Ad-p53感染的HepG2细胞上清液中均存在p53蛋白阳性表达。 2．CNHK500-p53和CNHK500在肝癌细胞中能随时间而大量复制增殖。而在正常细胞中基本不增殖，肿瘤选择性增殖能力明显优于WtAd5。在缺氧条件下，CNHK500-p53和CNHK500在肿瘤细胞和正常细胞内的增殖较常氧状态下均有增强，但在正常细胞中的增殖仍远远弱于在肿瘤细胞中的增殖。 3．CNHK500-GFP在正常BJ细胞中绿色荧光持续单簇、分散存在；而在肿瘤细胞中随着时间延长，绿色荧光的表达由散在、单个存在逐渐变为广泛、集中、融合存在，直至10天时荧光渐渐消散、淡去；Ad-GFP在正常BJ细胞和肿瘤细胞中绿色荧光持续单簇、分散存在；反映出CNHK500-GFP在肿瘤细胞中迅速复制、增殖，溶解细胞的过程。 4．CNHK500-p53对Bel-7402细胞具有很强的杀伤能力，在MOI=0.01时即可杀伤全部肿瘤细胞；在MOI=10时可以杀伤全部的HepG2肝癌细胞；而对正常细胞杀伤能力明显减弱，在MOI=100时感染BJ细胞，对该细胞仍无明显杀伤作用，直观地反映出CNHK500-p53对肿瘤细胞的选择性杀伤作用。 5．在肝癌细胞株HepG2和Bel-7402中，CNHK500-p53的IC<,50>分别为0.012和0.28，而在正常细胞株BJ中，IC<,50>为352.1，量化地反映出CNHK500-p53选择性杀伤肿瘤细胞。 6.实验结果表明三个治疗组同阴性对照组相比，能明显的抑制肿瘤生长，具有显著差异(P<0.05)。在三个治疗组中，CNHK500-p53疗效明显优于CNHK500和Ad-p53治疗组(P<0.05)。常规病理切片检查发现治疗组同对照组相比，肿瘤组织中有大量坏死灶出现，透射电镜检查检测到病毒治疗组的瘤体组织内腺病毒颗粒和晶格形成，说明增殖腺病毒能在肿瘤细胞内增殖，抑制移植瘤的生长。 结论： 1.本研究成功构建了由人端粒酶逆转录酶启动子调控Ela基因、人缺氧反应启动子调控Elb基因并携带p53基因的减毒增殖型腺病毒CNHK500-p53，并经PCR鉴定重组腺病毒构建正确。 2.体外实验表明重组病毒CNHK500-p53可以选择性地在端粒酶阳性的肝癌细胞中增殖、杀伤，而在正常细胞中基本不增殖，具有选择性肿瘤细胞增殖能力，对Bel-7402和HepG2的杀伤作用明显优于CNHK500和Ad-p53。病毒基因组外源性插入p53基因并不影响重组腺病毒的选择性复制和溶瘤作用。 3.体外实验表明：与非增殖型腺病毒Ad-p53相比，CNHK500-p53携带的目的基因能随病毒的增殖高效表达，并显示了更强的抗肿瘤作用；和增殖型腺病毒CNHK500相比，CNHK500-p53也显示了更强的抗肿瘤作用，提示溶瘤病毒介导的肿瘤基因治疗的优越性。 4．用CNHK500-p53治疗小鼠HepG2肝癌移植瘤模型观察到明显的抗肿瘤疗效，小鼠的肿瘤的生长速率明显慢于对照组。显示了CNHK500-p53潜在的肝痛治疗前景。