可再生的纤维素物质是生产燃料乙醇的重要潜在原料,而纤维素乙醇开发过程中的一个关键技术就是五、六碳糖的同时利用。目前工业上广泛用来发酵生产乙醇的酿酒酵母只能利用六碳糖而不能利用五碳糖。本实验室已经驯化出一株可以耐受高浓度乙醇的工业酵母,为了在该酵母的单倍体中引入五碳糖的代谢途径,本文运用遗传工程的手段,从树干毕赤酵母和粗糙脉胞菌中分别克隆到木糖代谢相关的基因,置于酿酒酵母内源强启动子的调控下,并通过一步转化法转化酵母细胞,以期能够最终实现酿酒酵母对五、六碳糖的利用。现阶段获得的主要结果如下:(1)提取酿酒酵母、毕赤酵母、粗糙脉胞菌的基因组,并通过PCR技术分别在48.5℃、46.4℃、54.4℃、50.7℃、61.6℃的退火温度下,克隆并测序了5个目标基因:酿酒酵母磷酸甘油启动子PGK、毕赤酵母木糖还原酶基因xyl1、毕赤酵母木酮糖脱氢酶基因xyl2、粗糙脉胞菌木糖还原酶基因xyl1、粗糙脉胞菌木酮糖脱氢酶基因xyl2。(2)优化了重叠延伸PCR方法,并通过该方法实现了PGK启动子与毕赤酵母和粗糙脉胞菌的木糖还原酶基因xyl1、木酮糖脱氢酶基因xyl2的单顺反子连接。(3)对本实验室驯化得到的可耐受高浓度乙醇的工业酵母进行产孢及单倍体拆分,并通过PCR验证了a/α两种交配型的存在。设计含有5S rRNA同源序列的外引物,通过PCR在连接后的基因外端加上同源重组臂,一步转化法转化上述酵母单倍体,并初步筛选克隆子。