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盾壳霉(Coniothyrium minitans)是核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)重寄生真菌,对作物菌核病有显著控制作用。分生孢子是盾壳霉生长发育的重要环节及其生防制剂的主体,研究和理解调控盾壳霉分生孢子形成的信号传导具有重要的理论意义和实践价值。前期研究表明精氨酸通过一氧化氮(NO)调控盾壳霉的分生孢子形成,但有关该信号分子在盾壳霉体内的传导机制和代谢途径还很不清楚。本论文对NO在盾壳霉中的生成、NO诱导分生孢子发育的信号传导途径以及其NO对产孢相关基因表达的影响等方面进行了研究,主要结果如下：第二信使cGMP仅在少数真菌中报道过,关于其生成和信号的生物功能还不清楚,本研究首次在高等真菌中证明了第二信使cGMP受NO信号的调控并传递生长发育信号。试验测定了盾壳霉中类似一氧化氮合成酶(NOS-like)的蛋白质催化活性,证实了盾壳霉中存在依赖L-精氨酸生成NO的蛋白质；通过使用可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)特异性抑制剂-ODQ对盾壳霉中sGC的活性进行了间接测定,发现ODQ在盾壳霉中可以明显抑制第二信使环鸟苷酸(cGMP)的积累；当用NOS和sGC的抑制剂处理盾壳霉野生菌株时,二者均可以抑制分生孢子器的正常发育,而外源添加cGMP可以逆转ODQ的抑制作用；实验表明盾壳霉体内NOS的活性、NO的水平和cGMP含量的变化动态表现出一致性,最高值都出现在分生孢子器发育的起始阶段,且cGMP的含量变化受内源和外源NO的调控；盾壳霉L-精氨酸缺陷型ZS-1T2029的产孢表型不能用外源cGMP互补,但可以用NO供体-硝普钠(SNP)互补,表明NO调控盾壳霉分生孢子形成应该有多条途径,包括第二信使cGMP和其他的信号传递途径,它们都是盾壳霉分生孢子发育所必需的。蛋白质S-亚硝基化修饰是NO发挥生物功能的重要途径,为研究该修饰方式对盾壳霉分生孢子形成的影响,本研究鉴定了S-亚硝基谷胱甘肽还原酶(CmGSNOR)在盾壳霉生长发育过程中的重要作用。该基因在模式生物中被发现具有代谢NO相关产物S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)、调节体内SNO的水平和进行蛋白质S-亚硝基化修饰等功能。我们采用基因敲除和基因互补、酶学催化活性检测等策略对CmGSNOR的功能进行了鉴定,CmGSNOR敲除转化子不能代谢GSNO,体内总SNO水平和NO含量上升；表现出生长缓慢、菌落和菌丝分枝异常、分生孢子产量下降、分生孢子形状变异和萌发提前等异常表型,这些异常表型可以通过基因互补得到恢复。基因敲除转化子对外源NO的压力抗性不变,但对亚硝基化压力非常敏感,对过氧化氢(H202)的抗氧化能力得到加强；进一步实验表明CmGSNOR基因的表达受GSNO的正调控但与外界氧化压力的影响关系不大。此外,还发现敲除转化子对由氯化钠所营造的高盐条件比野生菌株有更强的抗逆性。以上结果说明SNO的形成和代谢及其蛋白质S-亚硝基化修饰参与盾壳霉的多种生命活动。前期研究表明L-精氨酸可以增加盾壳霉突变体ZS-1T2029体内NO的生成,恢复其产孢表型,目前真菌中内源NO调控基因表达的研究尚未见报道。我们以盾壳霉L-精氨酸缺陷型ZS-1T2029为材料,应用抑制性差减杂交技术(SSH)构建了盾壳霉分生孢子形成阶段受NO上调表达的基因文库,构建了一个含有近2000个克隆的cDNA文库,通过反向Northern blot进一步筛选到412个表达有差异的信号,经过测序分析、去除重复序列后得到226个单一EST序列。参照MIPS数据库对这些EST可能编码的蛋白质进行功能分类,除了假定蛋白外,已知功能的蛋白质主要参与基本物质(17.9%)和能量代谢(8.6%)、蛋白质合成(13.2%)、蛋白质加工(9.9%)以及细胞转运(7.9%)等细胞进程,还有一些与细胞信号转导、转录调节和发育分化相关的蛋白质。使用半定量RT-PCR验证了其中13个候选基因在盾壳霉野生菌株中不同发育时期的表达情况,发现这些基因在分生孢子器形成时期的表达量均高于菌丝营养生长阶段。使用RNAi技术初步研究了两个上调表达基因CmFDSl和CmCAP1的功能,证明了它们是盾壳霉分生孢子发育所必需的。该研究鉴定出在盾壳霉分生孢子发育阶段上调表达的基因,为研究NO在真菌中的信号调控网络提供了很好的资源。总之,本研究初步阐明了NO在调控盾壳霉分生孢子形成中可能的信号传导途径：第二信使cGMP和蛋白质S-,亚硝基化修饰在分生孢子发育中均发挥了重要的调控作用；采用SSH技术筛选到对盾壳霉分生孢子形成相关的基因,有助于加深我们对盾壳霉产孢分子机理的理解。