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花粉萌发以及花粉管的快速极性生长,是被子植物双受精的关键。除此之外,花粉管也是研究细胞信号转导、细胞生长调控和细胞极性生长的良好模式系统。花粉和花粉管细胞感知外部信号后,通过信号转导级联反应,控制花粉萌发及花粉管的生长方向,以引导花粉管顺利到达胚珠释放精细胞。花粉管细胞的内环境,包括合适的离子浓度、微丝骨架的动态变化、囊泡转运的动态平衡等,对于花粉管的正常顶端生长都至关重要。Ca2+是植物细胞普遍存在的重要第二信使,在花粉萌发和花粉管生长过程中起着重要的调控作用,而且Ca2+信号系统和其他调控花粉管生长的信号系统存在紧密的联系,这些系统调控作用的实现可能有赖于Ca2+对其作用的进一步传递,因此普遍认为Ca2+信号在调控花粉萌发和花粉管生长的过程中处于“中心”位置。因此,进一步揭示花粉萌发及花粉管生长过程中的Ca2+信号转导网络,对于了解花粉萌发及生长的调控机制至关重要。钙调素类似蛋白(Calmodulin Like Protein; CML)是近年新发现的一类植物细胞所特有的Ca2+响应蛋白家族,在拟南芥中有50个成员。CML具有Ca2+的结合区域—EF手型结构(EF-hand motif),这也是所有Ca2+感受器蛋白的基本特征。目前对CML功能的研究才刚刚起步,尤其在花粉管系统中的功能未见报道。本论文工作以拟南芥CML家族基因CML24为研究对象,利用CML24的两个突变体,T-DNA插入突变体cml24-T1和点突变体cml24-4,以及CML24功能恢复及过表达突变体,解析CML24在拟南芥花粉管极性生长中的作用。结果如下：1、CML24在花粉和花粉管中表达,并参与花粉萌发及花粉管生长的过程。半定量RT-PCR和荧光定量PCR结果显示,CML24在花粉和花粉管中大量表达,且突变体cml24-T1和cml24-4的表达量均较野生型显著降低。体外和体内花粉萌发结果表明,cml24-T1和cml24-4的花粉萌发率、花粉管生长速率及长度均明显低于野生型。突变体的性状被表达CML24所恢复,说明cml24-T1和cml24-4的花粉萌发及花粉管生长缺陷表型是由CML24的功能缺失引起的；2、CML24亚细胞定位于细胞质中。利用叶肉细胞瞬时表达CML24：GFP融合蛋白,激光共聚焦显微镜结果显示CML24为细胞质定位,预示CML24可能主要在胞质中发挥作用；3、CML24的功能缺失降低了花粉管生长过程中对胞外Ca2+及K+的响应。胞外Ca2+及K+参与了花粉萌发及花粉管调控的过程,分别在花粉管体外萌发培养基中添加不同浓度的Ca2+和K++时,发现突变体cml24-T1和cml24-4的花粉管生长对胞外Ca2+、K+浓度变化不敏感,预示着突变体在控制离子转运上发生了改变；4、CML24的功能缺失改变了胞内Ca2+浓度。使用Ca2+检测荧光探针Fluo-3AM标记花粉粒和花粉管胞内Ca2+,结果显示cml24-T1和cml24-4胞内Ca2+含量明显高于野生型。推测CML24可能是通过调控胞内的Ca2+信号,进而调节花粉萌发和花粉管生长。也进一步明确了CML24可能作为Ca2+下游响应元件,参与花粉萌发及花粉管生长调控；5、CML24的功能缺失改变了花粉管微丝骨架的结构,并可能由此影响花粉管的生长过程。细胞骨架特别是微丝骨架的动态变化及结构排布,在调控花粉萌发和花粉管生长中发挥着非常重要的作用。利用Alexa-488phalloidin与F-actin特异性结合后,激光共聚焦显微镜观察,发现与Co1-0相比,cml24-T1和ml24-4突变体花粉管F-actin大部分呈现一种紊乱的状态。有的缺失亚顶端的致密结构,有的缺失纵向排布的微丝束。Col-0具有正常肌动蛋白结构的花粉管约占总检测花粉管的91.25%,而突变体这一比例仅为12.38%。胞外添加不同浓度的肌动蛋白抑制剂LatB时,与野生型相比,突变体的花粉萌发和花粉管生长对胞外LatB的浓度变化都是不敏感的。这些结果表明,微丝骨架在突变体中的结构变化可能是影响其萌发和花粉管生长的重要原因；6、体内和体外研究结果均表明,突变体cml24-4的花粉管转向异常。在向胚珠生长时,很多花粉管不能正确进入珠孔完成双受精,影响了种子的形成,导致cml24-4果荚结实率比野生型低。NO可能在花粉管的导向生长中发挥重要的作用。当NO浓度升高时,花粉管生长速率降低,生长方向随之改变。使用DAF-FMDA检测花粉管胞内NO含量,结果显示cml24-4花粉管NO含量明显高于Col-0。因此我们初步推断,cml24-4突变体花粉管胞内NO的升高导致花粉管向胚珠转向异常,改变了花粉管的生长方向,导致其不能正确的进入胚珠完成双受精,影响了果荚的结实率。但是以上结论的最终确定,还需要后续更多实验数据的支持。本论文的研究结果表明,CML24主要分布在胞质中,可能作为Ca2+信号的下游感受器正向调控拟南芥花粉管极性生长。CML24突变体Ca2+下游调控通路被阻断,同时下游信号途径引发反馈调控,导致胞内Ca2+浓度增加,也同时造成花粉管生长对胞外Ca2+浓度变化不敏感。突变体胞质Ca2+浓度的升高,引起花粉管细胞骨架结构紊乱,进而影响花粉管的生长速率。而CML24突变体花粉管的转向异常现象,可能是由于胞内NO浓度升高所致,并最终造成了突变体结实率的降低。本论文以Ca2+信号感受器CML24作为研究对象,采用分子生物学和细胞生物学等方法,探讨了CML24在调控花粉管极性生长中的功能,推测CML24参与了Ca2+信号、微丝骨架排布,以及NO信号,并进而影响花粉萌发及花粉管的生长及转向,为进一步研究花粉管信号转导网络及调控机制奠定了基础。