急性冠脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)是一组严重威胁人类健康的疾病。包括不稳定型心绞痛(Unstable Angina,UA)、急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction,AMI)和心源性辞死(Sudden Cardiac Death),是冠心病的严重阶段,世界上最常见的死亡原因之一,对其深入的研究具有更深远的临床意义。近年来研究发现,ACS各型涉及脂质代谢的不平衡,动脉斑块破裂和动脉壁的炎症反应,尤其是局部病灶和外周循环血CD4+T淋巴细胞活化、分化和浸润的炎症性过程很可能对急性冠脉综合征的病理生理过程起了关键作用。现代免疫学认为,幼稚CD4+Th(T-help)能分化成至少四种类型的成熟辅助性T细胞,根据细胞因子的表型不同,可划分为Thl,Th2,Th17和调节性T(Treg)细胞。在人类的许多炎症反应包括动脉粥样硬化所致的ACS均有上述细胞因子的参与。IFN-γ是一个Thl型细胞因子,促进动脉硬化斑块形成,相反,Foxp3是由Treg细胞分泌的具有炎症调节作用的细胞因子。可以延缓动脉硬化斑块的发生发展。在ACS患者中发现Thl和Treg细胞均有所增加,然而,是什么原因促使了 ACS中这些炎症因子的改变,迄今为止尚未见有确切的研究报道。自主神经系统功能失调(autonomic nervous system,ANS)对ACS的发生发展起了关键作用。心率变异性(heart-ratevariability,HRV)是自主神经功能的一个临床常用简便易操作的检测指标,其指数的降低预示着交感神经的过度激活。且与ACS及炎症反应有关。基础研究显示,各种免疫细胞,包括T细胞表达β肾上腺素受体(β adrenergic receptors,βARs)信号,去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)对T淋巴细胞功能的调节作用是由βARs介导,并与G-蛋白偶联的环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)受体后信号转导途径有关。T细胞内cAMP增加可产生T细胞的活化和增殖抑制作用。我们先前的研究发现,冠心病所致的心力衰竭Th功能失调与cAMP生成减少有关,β受体阻滞剂可通过提高β-ARs介导的的cAMP生成,改善Thl/Th2平衡。因此推测,如果对β-ARs-环磷酸腺苷(cAMP)系统的关键环节进行干预,可能会起到类似的作用。G蛋白偶联受体激酶2(G protein-coupled receptor kinase-2,GRK2)是βARs通路的关键调节酶。其生物学作用是使已激活的βARs磷酸化,促使已激活的βARs与G蛋白解耦联,最终降低βARs与激动剂的反应性,使受体减敏,腺苷酸环化酶活性降低,致cAMP生成减少。GRK2在心脏高表达,对心脏功能有重要调节作用。心梗时心肌GRK2表达增加,活性增强,可加速心梗后心衰的进展,心功能恶化,对心脏βARs信号系统起着有害的作用。通过基因敲除抑制GRK2可以有效改善心衰动物模型的心功能。因此,GRK2被公认为治疗心肌梗死的潜在治疗靶点。近年来,研究发现,淋巴细胞也具有βARs信号转导功能,而且在急性心肌梗死后随着心脏功能恶化,淋巴细胞GRK2水平呈逐渐升高趋势。淋巴细胞具有的这种βARs,多年来一直用于心脏实质细胞的替代研究。然而这种高交感神经激素如去甲肾上腺素(NE)作用下的淋巴细胞βARs系统的改变,很可能是ACS发作Th细胞功能变化的主要因素之一。帕罗西汀是一种选择性5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitors,SSRIs),常常被用于缺血性心脏病伴抑郁的患者。最近,几份研究揭示了帕罗西汀可以作为一种GRK2直接抑制剂改善心肌梗死后心衰的动物模型的心肌收缩力,而它对于心脏功能改善中的临床效果仍未确定。本研究拟通过ACS患者NE、肾上腺素(EPI),HRV和外周血淋巴细胞内GRK2对Th17,Treg等细胞因子和心功能的相关性调节,观察GRK2抑制剂治疗AMI伴抑郁患者上述部分关系的变化,探讨ACS时交感神经系统对Th细胞功能的影响及帕罗西汀通过交感神经-GRK2通路调节AMI伴抑郁患者心功能的作用。为从交感神经-GRK2通路调节免疫治疗和预防ACS提供可靠的理论依据及潜在可能性。本研究的主要内容包括两个部分:第一部分ACS患者Th淋巴细胞亚型的表达及交感神经系统对其表达的影响研究目的急性冠脉综合征(ACS)涉及自主神经功能失调和T辅助淋巴细胞因子的变化。然而,交感神经过度激活对免疫Th细胞的作用尚不清楚。本研究旨在对急性冠脉综合征(ACS)患者自主神经功能变化及外周血T辅助淋巴细胞亚型表达的相关性研究,探讨辅助淋巴细胞亚型表达的调节及临床意义。研究方法随机选择103冠心病患者,根据入选标准最后选定65例冠心病患者,其中SAP患者22例,UAP患者22例,AMI患者21例,另随机选择非冠心病患者(NCA)23例作为对照组。流式细胞仪测定淋巴细胞Thl和Treg细胞因子水平;放免法检测外周血淋巴细胞GRK2;酶联免疫法(ELISA)检测血浆IL-6,IL-17,IL-4,andTGF-β和淋巴细胞PKA水平;高效液相色谱法(HPLC)进行外周血EPI和NE测定;T-betandSTAT-5蛋白表达水平采用westemblot方法测定;动态心电图分析心率变异性(HRV)高频(HF),低频(LF),总体标准差(SDNN),心动周期标准差的平均值(SDNN-Index);心脏彩超测定左室心功能(LVEF)。数据用均数±标准差(χ±s)表示,两两比较用t检验,组间比较用单因素方差分析,两两比较用t检验,相关分析用多元线性回归分析检验,用GraphPadPrismX6统计软件进行分析处理,主要统计指标均进行正态性检验。P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.血浆NE、EPI浓度,外周血T淋巴细胞GRK2、PKA活性和Treg、Th1细胞因子的变化随着CAD严重程度增加,血浆NE、EPI浓度及外周血T淋巴细胞GRK2、PKA活性逐渐升高(均p<0.01),而在SAP和NCA患者中,上述指标无明显差别(p>0.05);分别以CD4+T内IFN-γ和Foxp3+代表Th1和Treg型细胞,发现在UAP和AMI中,Foxp3+/CD4+ 明显低于NCA和SAP,(p<0.001),但在UAP和AMI两组或NCA和SAP 两组中Foxp3+/CD4+无明显差别,(p = 0.6905;p = 0.1552);与NCA和SAP相比,IFN-γ+/CD4+在UAP中明显升高(p<0.01)而在AMI中表现最高(p = 0.0078)。2.CAD患者PBMCs中T-bet和STAT-5蛋白表达AMI患者中T-bet蛋白表达明显高于其他三组(p<0.01),而UAP组高于NCA和SAP组,但在NCA和SAP两组中无差异。相反地,STAT-5蛋白表达显著低于其他三组(p<0.01),而UAP组显著低于NCA和SAP组,但在NCA和SAP两组中无差异(p<0.01)。3.Th亚型与儿茶酚胺类激素水平在CAD患者中的相关性分析多元线性回归分析显示了 Th亚型与儿茶酚胺类激素水平在CAD患者中的相关性。发现在CAD患者中Foxp3-Treg频数与NE和EPI浓度均呈负相关(r=-0.5799,p<0.001;r=-0.5099,p<0.001)(图3a,3b);IFN-γ-Th1频数与NE和EPI浓度均呈正相关(r=0.5559,p<0.001;r=0.5422,p<0.001)。4.Th亚型与EPI水平在NCA+SAP组和UAP+AMI组患者中的相关性分析多元线性回归分析在NCA+SAP组和UAP+AMI组患者中Th亚型与EPI的相关性。发现在NCA+SAP组和UAP+AMI组中,Foxp3-Treg频数与EPI浓度均呈负相关(r=-0.3522,p=0.0177;r=-0.3770,p=0.0127);而IFN-γ-Th1频数与EPI浓度均呈正相关(r= 0.3580,p=0.0158;r= 0.3654,p=0.0160)。5.Th亚型与NE水平在NCA+SAP和UAP+AMI组患者中的相关性分析多元线性回归分析在NCA+S AP组和UAP+AMI组患者中Th亚型与NE的相关性。发现在NCA+SAP组和UAP+AMI组中,Foxp3-Treg频数与NE浓度均呈负相关(r=-0.3659,p=0.0135;r=-0.3707,p=0.0144);而IFN-γ-Th1频数与NE浓度均呈正相关(r=0.3620,p=0.0145;r= 0.4417,p=0.0030)。6.GRK2-PKA与Th亚型在CAD患者中的相关性分析多元线性回归分析CAD患者GRK2表达与EPI和NE的相关性。发现在CAD患者中,GRK2表达与EPI和NE均呈显著正相关(r=0.4227,p<0.001;r=0.4971,p<0.001);Foxp3-Treg频数与PKA活性呈负相关(r=-0.4812,p<0.001);而IFN-γ-Th1频数与PKA活性呈正相关(r=0.6095,p<0.001);PKA活性与GRK2表达呈正相关(r=0.5318,p<0.001)。7.HRV与Th亚型、GRK2和PKA相关性分析使用多元线性回归模型,评价CAD患者交感神经指数HRV与Th亚型、GRK2和PKA相关性,进而研究SNS对Th细胞亚型的的影响。Foxp3与HRV指数呈正相关(p<0.05),与NE,EPI呈负相关(p<0.01);IFN-y与HRV指数呈负相关(p<0.05),与NE,EPI呈正相关(p<0.01);GRK2与HRV指数呈负相关(p<0.01),与NE,EPI呈正相关(p<0.05);PKA与HRV指数呈负相关(p<0.05),与NE,EPI呈正相关(p<0.01)(表2)。这说明CAD患者GRK2活性与交感神经激素释放增加有关,而Th细胞分化又与GRK2活性增加有关,因此推测Th细胞分化过程与交感神经系统调节有关。9.血清其他细胞因子的变化与NCA和SAP患者相比,UAP和AMI的患者血清中IL-6和IL-17的浓度显著地增加了(p<0.001),而TGF-β浓度显著地降低了(p<0.001);而且在AMI患者中,IL-6和IL-17水平较UAP中显著升高(p<0.001);IL-6在NCA and SAP中,IL-17在NCA和SAP中,以及IL-4在四组中均无显著差异(p=0.71 05;p=0.7988;F3,52=0.3040,p=0.8224)。结论交感神经过度活跃和CD4+ T分化异常都可能导致ACS患者的斑块不稳定和急性心脏事件。交感神经系统至少部分的通过GRK2-PKA通路调节这种免疫系统的改变,从而影响心血管疾病的发病机制及其临床结果。为冠心病的诊治提供新的理论依据。第二部分基于交感神经-GRK2通路调节AMI伴抑郁患者心功能的干预研究研究目的GRK2被公认为是治疗心肌梗死的潜在治疗靶点。帕罗西汀,一个选择性5-羟色胺受体再摄取抑制剂,常被用于缺血性心脏病伴抑郁的治疗。近来研究发现,帕罗西汀可以作为一个GRK2的直接抑制剂,能够逆转心肌梗死后实验动物的心肌重塑,改善心功能,而它对于心脏功能改善中的临床效果仍未确定。我们通过帕罗西汀与另一个选择性5-羟色胺受体再摄取抑制剂但是非直接GRK2抑制剂的氟西汀相比较,观察帕罗西汀对心梗合并抑郁患者心功能及抑郁状态的作用。研究方法1.病例选择随机选择急性心肌梗死(AMI)患者308例,依据AMI的诊断标准选择患者:缺血性胸痛超过30分钟但不超过24小时;18导同步心电图相邻两个导联持续性ST段抬高≥0.1 mV,或ST段压低,T波倒置;心肌坏死标志物cTnⅠ升高大于10倍以上。根据标准的操作流程,所有患者均进行冠脉造影检查。入院24-48小时内,根据HAMD-17评分和SDS评分,其中67(23%)名心梗患者伴随着抑郁状态,最终,308名患者中有292人完成了为期8周的实验。本实验是一个随机、双盲前瞻性研究。2.给药方法收集患者的病史、实验室检查、影像学数据,以及性别、年龄、服用药物、心血管危险因素等基本信息。入选患者均行AMI的标准化治疗,包括:阿司匹林、氯吡格雷或替格瑞洛、他汀、β阻滞剂、钙离子拮抗剂、ACEI和硝酸盐类。67名AMI伴抑郁患者中,23人被随机给予帕罗西汀,23名给予氟西汀,另21名不给予抗抑郁药,帕罗西汀和氟西汀每日剂量初始10mg/日,1周内根据个体反映增加至每日20 mg/日耐受量。共治疗8周。8周后使用调查问卷随访进行再评价心梗后心绞痛、再发心梗发病和抑郁评分等情况。3.Western blot分析GRK2蛋白表达4.高效液相色谱法(HPLC)电化学法测定NE和EPI浓度5.HRV分析动态心电图分析心率变异性(HRV)高频(HF),低频(LF),总体标准差(SDNN),心动周期标准差的平均值(SDNN-Index)6.心脏彩超测定左室心功能(LVEF)。7.统计学分析对连续变量采用均数±标准差表示,比较AMI和AMID两组GRK2水平用t检验,组间差异用单尾或双尾方差分析或χ2检验。抑郁评分,HRV变异性和GRK2水平间的组间用Pearson’s检验,多元回归分析分析儿茶酚胺激素、HAMD-17和SDS评分、GRK2之间的相关性。使用GraphPadX6(GraphPad软件,圣地亚哥,加利福尼亚)和SPSS(21.0,SPSS/IBM公司,芝加哥,伊利诺伊州,美国);软件进行数据分析。取95%的可信区间,P<0.05为差异有统计学意义。结果一、AMI和AMID中GRK2的蛋白表达外周血淋巴细胞GRK2蛋白表达(2.054 ± 0.5661)在AMID患者中明显比AMI(1.758 ±0.6021,p = 0.0065)患者升高。在急性心梗伴抑郁和急性心梗不伴抑郁两组治疗后,GRK2蛋白水平均较治疗前降低;而急性心梗伴抑郁患者抗抑郁治疗后较急性心梗不伴抑郁治疗后,GRK2蛋白水平降低更显(P<0.04)。二、AMID患者自主神经功能与抑郁状态和GRK2表达相关性在AMI患者HAMD-17评分与HRV指数呈负相关;SDS评分与SDNN、HF、LF/HF呈负相关;淋巴细胞GRK2与SDNN、LF/HF呈负相关。三、心梗标准治疗联合抗抑郁治疗效果1.帕罗西汀和氰西汀对AMID患者GRK2的影响治疗前AMID患者GRK2蛋白水平在帕罗西汀组、氟西汀组和不加抗抑郁组三组间无差别,(P>0.05);治疗8周后,三组患者GRK2水平较各自的治疗前均有所降低,(P<0.01);进一步的,在帕罗西汀组,治疗后GRK2水平较其他两组治疗后降低最显著(P<0.01);而在氟西汀和不加抗抑郁治疗组比较两组间GRK2水平无差别(P = 0.8312)2.抗抑郁治疗对AMID患者抑郁评分/HRV指数/儿茶酚胺激素/心功能的影响AMID患者帕罗西汀组和氟西汀组HAMD-17和SDS评分较不加抗抑郁治疗组明显改善(P<0.01),而在帕罗西汀组和氟西汀组两组间比较,HAMD-17和SDS评分无明显差别(P>0.05);三组患者HRV指数在8周治疗后均较治疗前提高了;而三组患者EPI和NE在8周治疗后均较治疗前降低了。更有意义的是,治疗后,帕罗西汀治疗组较氟西汀组LVEF,EPI,NE,HF,LF和LF/HF改善显著(P<0.01)。而且抗抑郁治疗组较不加抗抑郁治疗组,心梗后心绞痛(PIAP),再发心梗(RMI)发生率明显降低3.抗抑郁治疗对AMI和AMID患者抑郁指数/HRV/心功能的作用AMID与AMI患者相比中,HAMD-17和SDS评分显著升高(P<0.01)(表4),而HRV指数(SDNN,HF,LF,LF/HF)明显降低(P<0.01);AMID患者抗抑郁治疗后,HAMD-17和SDS评分较治疗前降低(P<0.01);两组治疗后,HRV指数升高,儿茶酚胺激素水平降低(P<0.01)4.不同性别AMID患者抗抑郁治疗作用比较在治疗前或治疗后,男女AMID患者GRK2,HAMD-17,SDS评分,HRV指数(SDNN,HF,LF,LF/HF),和心功能(LVEF)各参数均无明显差别(P>0.05)。经过8周治疗,上述参数较治疗前均有显著改善(P<0.01)结论帕罗西汀具有选择性5-羟色胺再摄取抑制和GRK2抑制双重作用,可以通过直接抑制GRK2机制和选择性抑制5-羟色胺再摄取方式调节交感神经兴奋性,改善心梗伴抑郁患者的心功能。为帕罗西汀治疗AMI患者提供了新的临床依据。