蚕蛹活性肽组分对MGC-803细胞线粒体凋亡途径的影响

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蚕蛹作为我国传统优势行业-丝绸业的主要副产物,蚕蛹年产量超过20万吨,蚕蛹蛋白含量高达60%-71.9%(干物质),是非常优质的蛋白质资源。大量研究表明:蚕蛹蛋白经蛋白酶水解后,可以得到多种具有生物活性的短链肽。本文以蚕蛹蛋白为原料,利用可控酶解技术制备蚕蛹蛋白酶解产物,并研究其对人胃癌MGC-803细胞的体外增殖抑制活性,再此基础上进一步探讨活性肽段对细胞形态学、细胞周期以及对线粒体凋亡代谢通路的影响。运用膜超滤、G-25葡聚糖凝胶层析、半制备液相色谱等手段分离纯化高活性的肽段,并对肽段进行一级、二级质谱鉴定。具体研究内容及结论如下:(1)蚕蛹活性肽组分对MGC-803细胞形态具有显著影响通过借助普通光学显微镜、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、透射电子显微镜等手段观察MGC-803细胞在蚕蛹活性肽组分刺激下的凋亡形态变化进程。结果表明:普通光镜下,发现正常的梭形细胞逐渐变圆,伪足收缩,核皱缩,细胞折光率下降。荧光显微镜下,正常组细胞基本无荧光染色,但实验组凋亡早期细胞与坏死细胞特征明显。激光共聚焦显微镜下,细胞微丝逐渐失去其规律的束状结构,连贯性逐渐变差,微管蛋白发生解聚并呈弥散状分布在细胞内,细胞骨架逐渐塌陷解体。透射电镜下,凋亡细胞染色质浓缩成斑,线粒体轻度水肿,内质网扩张,自噬体开始增多,出现凋亡小体。(2)蚕蛹活性肽组分对MGC-803细胞线粒体代凋亡途径具有显著影响以蚕蛹活性肽组分对MGC-803细胞的促凋亡效应为切入点,借助流式细胞仪测定细胞凋亡率、分析细胞周期,RT-PCR分析mRNA表达量,Western Blot测定蛋白表达水平,从代谢的角度解释SPPH 3调控线粒体凋亡的信号通路。结果表明:SPPH3(0.31mg/mL)刺激后的MGC-803细胞凋亡率为64.80%,凋亡率与作用浓度呈正相关,上调药物浓度(1.25mg/mL),凋亡率达到93.63%。SPPH3对细胞周期的阻断作用主要发生在G0/G1期:G0/G1期含量为45.17%(p<0.05),S期则降低至21.25%。SPPH 3刺激细胞后,可以在线粒体凋亡通路中上调Bax、下调Bcl-2蛋白的表达量,促进Cyt C的释放,激活Caspase家族基因的联动反应,从而激活线粒体凋亡通路。(3)蚕蛹活性肽组分的纯化与结构鉴定Novozymes 37071碱性蛋白酶对蚕蛹蛋白进行酶解获得酶解产物,经测定,所得SPPHs的相对分子量主要在在1-3k Da的范围内,其含量约为49.63%。以DPPH自由基清除能力,FRAP铁离子还原能力、ABTS总抗氧化能力指标为评价指标,结合MGC-803细胞的体外增殖抑制活性(IR)作用综合分析。结果表明:9组SPPHs均具有不同程度的抗氧化活性,其中DPPH自由基清除能力与IR呈高度相关(r=0.80);以DPPH自由基清除能力为指标,可以判定SPPH 3(DH=25%,Mw<3k Da)组分具有最优的生物活力。另外,经HPLC-Q-TOF-MS测定,SPPH 3中的目标肽段的分子量为679.45 Da。
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