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严重的创伤、感染可导致机体炎症反应失控,最终引发内毒素血症及肝功能衰竭。研究表明,黄连(Rhizoma Coptis,RC)具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、止痛、降血糖、保肝解毒等诸多生物学活性,但其对LPS引起的肝细胞损伤的保护及其作用机制尚未见报道。故本试验以黄连(RC)水提物为试验药物、地塞米松(Dexamethasone,DEX)为阳性对照药物、体外培养的大鼠肝细胞(BRL cells)为靶细胞,采用脂多糖(LPS)构建肝细胞损伤模型后,进行以下几方面的研究:CCK-8法筛选RC的无毒浓度及LPS的损伤浓度,CCK-8法检测RC与LPS共同作用于BRL细胞24 h时细胞存活率,流式细胞术检测BRL细胞凋亡率,RT-PCR检测TLR4上的NF-κB、IRF3两条信号传导通路上mRNA相对表达量变化,荧光倒置显微镜观察NF-κB p65蛋白核转移等。结果如下:(1)筛选RC的无毒浓度及LPS的损伤浓度:RC的无毒浓度为0.175 mg/mL,LPS的损伤浓度为0.1 mg/mL;同时发现,RC浓度在0.0625~0.125 mg/mL时对BRL细胞有促增值作用。经再次筛选,认为0.1 mg/mL RC促增殖作用最好。(2)RC与LPS共同作用于BRL细胞24 h时细胞存活率检测:CCK-8结果表明,与LPS处理组相比,RC在0.175 mg/mL时能使BRL细胞存活率从73.79%增加至81.62%;0.1 mg/mL时能使BRL细胞存活率升高至91.23%。即RC浓度为0.1 mg/mL时,保护作用较好。(3)细胞凋亡率检测:BRL细胞正常对照组、LPS处理组、0.175 mg/mL RC+LPS干预组、0.1 mg/mL RC+LPS干预组、0.0001 mg/mL Dex+LPS阳性对照组的总凋亡率(%)分别为:0.32±0.04、19.26±0.65、16.43±0.73、9.33±0.47、6.34±0.43。RC干预组与LPS处理组比较,细胞总凋亡率显著下降(p<0.01),其中,RC为0.1mg/mL能使BRL细胞凋亡率由19.26%降低至9.33%。可见RC能有效抑制LPS诱导的BRL细胞凋亡,且RC在0.1 mg/mL时效果更好。(4)荧光定量PCR检测:与正常对照组相比,LPS处理组可使TNF-α、IL-1β、IL-6、TLR4、NF-κB和IRF3 mRNA的表达显著上升(p<0.05),说明LPS诱导的损伤通过TLR4/NF-κB通路和TLR4/IRF3通路,最终导致炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α释放,从而损伤肝细胞;与LPS处理组相比,RC干预组均可抑制上述基因表达上调(p<0.05),对肝细胞损伤起到保护作用,其机制与TLR4/NF-κB通路和TLR4/IRF3通路有关。(5)免疫荧光检测:BRL细胞正常对照组中,FITC标记的NF-κB p65蛋白主要分布在细胞质中,显现绿色荧光,DAPI染色后细胞核呈蓝色荧光;LPS处理的BRL细胞,胞质中绿色荧光减弱,胞核颜色由深蓝色变为浅绿色;经RC处理后,BRL细胞核颜色变为不同程度的蓝绿色。该结果表明,在LPS作用下部分NF-κB p65蛋白由细胞质转移到了细胞核,而RC干预组均可不同程度的抑制LPS诱导的NF-κB p65核转移,且RC在0.1 mg/mL时效果明显。结论:黄连对LPS诱导的大鼠肝细胞损伤具有明显保护作用,能显著改善细胞生长状态,减轻LPS导致的细胞毒性,降低细胞凋亡率。其机制为,黄连可以影响TLR4信号通路,阻碍NF-κB和IRF3通路激活,抑制NF-κB p65蛋白入核,减少炎症因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等的释放。