绝经后女性是原发性骨质疏松症(Ι型)的高危人群,近年的研究发现,原发性骨质疏松症(Ι型)发生除了与雌激素缺乏有关,还可能与铁蓄积有关。女性随年龄增长雌激素下降,铁蓄积增加,同时骨质疏松症发生率也增高,那么,铁蓄积是雌激素下降导致还是机体独立因素导致?雌激素、铁元素及骨代谢三者关系如何?明确雌激素、铁元素对骨代谢的影响及相互关系对解释“铁蓄积是否独立影响骨质疏松”有深刻意义。在此研究背景下,本课题结合临床资料、动物实验及细胞实验分层研究雌激素存在及缺乏情况下,铁蓄积对骨代谢的影响及相关的作用机制,旨在阐明雌激素、铁元素及骨代谢三者关系。本课题具体研究内容如下:第一部分子宫切除的年轻女性铁代谢指标及骨代谢指标的临床观察。子宫切除的年轻女性与绝经后女性的共同点是停止月经排出,不同点是年轻女性的雌激素水平正常,绝经后女性是雌激素缺乏的,这部分的研究目的:子宫切除的年轻女性血清铁代谢及骨代谢变化,以及卵巢功能正常情况下,铁代谢指标与骨代谢指标之间的相互关系。第二部分雌激素对“铁蓄积”小鼠骨代谢的影响及相关机制。为了进一步论证临床资料的结果进行详细的动物实验的研究。本部分的研究目的:观察雌激素的有无对铁蓄积小鼠骨量、骨转换指标及氧化应激的影响,初步探讨可能的机制,进一步明确雌激素、铁及骨代谢三者的关系。第三部分雌激素与铁的联合作用对成骨细胞、破骨细胞分化及增值活性的影响及相关机制研究。为了进一步论证动物实验的结果及可能的机制,进一步进行细胞实验的研究,研究成骨细胞、破骨细胞在铁与雌激素的共同干预下,各自生物活性指标变化,并探讨活性氧ROS在其中的作用。第一部分子宫切除的年轻女性铁代谢指标及骨代谢指标的临床观察目的:研究子宫切除的年轻女性血清铁代谢及骨代谢变化,以及卵巢功能正常情况下,铁代谢指标与骨代谢指标之间的相互关系。方法:以2002年06月至2010年10月因子宫肌瘤行子宫切除术而保留双侧附件的女性41例为研究组对象,年龄38~44岁,平均年龄(41.78±2.13)岁;子宫切除时间3~11年,平均(5.31±1.79)年。另随机抽取无子宫和卵巢手术史,有规律月经的生育期女性35例为对照组。检测性激素相关指标[包括雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)]、铁代谢相关指标[包括铁蛋白(FER)、总铁结合力]和骨代谢相关指标[包括Ⅰ型原胶原氨基端延长肽(P1NP)、Ⅰ型胶原C端肽β降解产物(β-CTX)、股骨颈及腰椎骨密度]。采用t检验、多元逐步回归分析,探讨铁代谢指标与骨代谢指标在子宫切除年轻女性中的现象和关系。结果:两组女性年龄、身高、体重、血红蛋白、白细胞计数、肝功能、肾功能、血脂、血糖比较,无统计学意义(P>0.05)。两组女性的性激素、铁代谢及骨代谢指标比较,研究组铁代谢相关指标血清FER值(119.75±43.72)ng/m L,显著高于对照组(27.66±23.62)ng/m L(t=11.004,P<0.01),总铁结合力(51.07±8.82)umol/L显著低于对照组(56.99±3.90)umol/L(t=-3.673,P<0.01)。两组E2、LH、FSH、P1NP、β-CTX、股骨颈及腰椎骨密度T值均在正常范围内,校正混杂因素后,血清铁蛋白仅与子宫切除时间呈正相关(?=13.673,P<0.01),与E2、LH、FSH、PINP、?-CTX、ALP无显著相关性(?=0.40,2.171,-1.093,-0.436,-0.068,0.469,P=0.652,0.094,0.990,0.819,0.416,0.144)。结论:子宫切除的女性出现铁蓄积现象,子宫切除后停止月经排血是导致铁蓄积的重要原因之一,在雌激素正常情况下,铁蓄积对骨代谢无明显作用。第二部分雌激素对“铁蓄积”小鼠骨代谢的影响及作用机制目的:观察雌激素的有无对铁蓄积小鼠骨量、骨转换指标及氧化应激的影响。方法:建立高铁小鼠模型,将小鼠随机分为对照组(Con组)、雌激素正常的高铁组(F组)、雌激素缺乏的去势组(OVX组)、雌激素缺乏的高铁去势组(F+OVX组)。Con组及OVX组注射生理盐水,其余两组注射的是枸橼酸铁(FAC),4周后对股骨远端进行了普鲁士蓝铁染色,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清的铁蛋白(Fer)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(osteocalcin)、骨转换指标I型胶原C端肽(CTX)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP-5b)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD);股骨远端行Micro-CT三维分析,提取各组小鼠股骨的骨髓细胞进行破骨细胞的培养,抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞分化活性。反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测小鼠胫骨相关基因表达。结果:F组[(335.30±44.10)μg/L]及F+OVX组[(324.80±38.60)μg/L]血清铁蛋白的含量明显升高(P<0.001),且股骨远端铁染色着色明显。ELISA结果示:雌激素正常的F组与Con组比较,CTX、TRAP-5b、MDA、SOD组间差异无统计学意义(P>0.05),F组ALP及osteocalcin表达量较Con组明显降低(P<0.001,P=0.002);而雌激素缺乏的两组,铁剂干预后,MDA、TRAP-5b、CTX明显升高(P=0.004,P<0.001,P<0.001),SOD、ALP、osteocalcin则降低(P<0.001,P<0.001,P=0.002)。Micro-CT分析表明:雌激素存在时,对照组与铁干预组骨密度及相关指标差异无统计学意义(P>0.05);雌激素缺乏时,与OVX组比较,F+OVX组骨量下降更为严重(P<0.001)。TRAP染色显示雌激素正常时,各组小鼠破骨细胞数无明显差异(P=0.501);雌激素缺乏时,F+OVX组破骨细胞数明显高于OVX组(P<0.001)。结论:雌激素存在情况下,FAC对骨量、骨吸收影响甚微;雌激素缺乏情况下,FAC能显著增强破骨活性,使骨量下降。第三部分雌二醇与铁的联合作用对成骨细胞及破骨细胞分化、增殖活性的影响及作用机制目的:研究成骨细胞、破骨细胞在铁与雌二醇的共同干预下,成骨细胞及破骨细胞分化、增殖生物活性各指标变化,并探讨活性氧ROS在其中的作用。方法:1、成骨细胞选取小鼠颅骨原代细胞,分组如下:对照组(Con组)、铁干预组(FAC组)、雌二醇干预组(E2组)、铁&雌二醇干预组(FAC+E2组),各组用相应的10μM枸橼酸铁胺(FAC)及10n M雌二醇(E2)干预,3d后行碱性磷酸酶(ALP)染色,10d后取培养基上清检测ALP活性;反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测成骨相关基因[Runt相关转录因子2(Runx2)、成骨细胞特异性转录因子(osterix)、骨保护素(OPG)、骨钙素(Bglap)]差异。2、破骨细胞选取细胞系RAW264.7,分组同成骨细胞,以50μM FAC及10n M E2干预,TRAP染色及噬骨陷窝实验检测破骨细胞分化差异,RT-PCR检测破骨相关基因[组织蛋白酶(CTSK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、降钙素受体(CALCR)]差异,荧光酶标仪检测成骨细胞及破骨细胞活性氧(ROS)。结果:1、成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)染色检测结果示,雌激素存在或缺乏情况下,FAC均能抑制碱性磷酸酶(ALP)活性;基因水平上,FAC显著下调Runx2、osterix基因表达水平(P<0.05),该作用与雌激素无关。2、破骨细胞TRAP染色结果示:FAC能显著增加TRAP染色阳性细胞数(P<0.05),而当雌二醇存在时,该作用被抑制。噬骨陷窝的实验也得同样的结果。RT-PCR结果:无雌二醇干预情况下,铁剂能显著上调MMP9、TRAP、CTSK、CALCR基因表达水平(P<0.05),当雌二醇存在时,两组基因的表达无明显统计学差异。活性氧ROS检测结果:在成骨细胞及破骨细胞中,FAC均能增加ROS活性(P<0.05),而雌二醇则能下调活性氧水平(P<0.05)。结论:雌二醇与铁在骨代谢中的拮抗作用可能与骨吸收过程相关,而与骨形成过程无关。仅当雌二醇缺乏情况下,铁才能通过上调ROS,进而促进破骨细胞分化。