疾病是影响家畜生产的主要因素,在发达国家,由疾病造成的损失占家畜生产总成本的17%左右,而在发展中国家,损失则高达35～50%。多种病原菌感染引发的奶牛乳腺炎,是奶牛常见的多发性疾病,给世界各国奶牛业造成巨大经济损失。目前已有多种方法来防控奶牛乳腺炎,虽然也取得了一定的临床效果,但却引发了耐药菌株和抗生素残留等公共卫生问题。因而,应用现代分子生物学技术分析抗性和易感群体中候选基因的标记等位基因频率差异,结合遗传育种技术,从根本上提高家畜的抗病性与健康水平已成为当今家畜抗病育种研究的热点。补体(Complement)作为存在于人或脊索动物血清和组织液中的一组不耐热的经过活化后具有酶活性的球蛋白,其作用主要表现在溶解细菌和病毒、杀伤肿瘤细胞及感染病毒的细胞、免疫粘附和调理吞噬以及作为炎症介质上。补体成分3(C3)位于补体经典途径、甘露糖结合凝集素途径和补体旁路途径三条激活途径的汇合点,是补体系统最重要的分子;而且C3裂解片段及其结合蛋白复杂多样,不仅可以通过自身的激活、裂解,参与补体的级联反应,还可以与各种相关因子发生相互作用,完成对病原菌的免疫粘附和吞噬作用,对补体系统进行调节。因而,C3在免疫防御、免疫调控以及免疫病理中发挥着重要的作用。当C3基因发生突变或缺失时会造成C3缺陷性疾病,常伴发免疫性疾病及反复细菌感染,患者对病原菌感染的易感性显著增加。运用蛋白电泳分型技术和PCR限制性酶切片段多态性(PCR-RFLP)、PCR单链构象多态性(PCR-SSCP)及DNA测序技术分析人、猪、小鼠及羊等哺乳动物中的C3基因,发现其存在多态性,众多研究表明C3多态性与某些补体缺失性疾病、炎症反应及精神性障碍疾病均有着重要的关联性。中国荷斯坦奶牛是由引进的纯种Holstein公牛与本地母牛的高代杂交种,经长期选育而成,产奶量较高,但乳腺炎发病率也高达38%～50%。而鲁西黄牛和渤海黑牛是山东省特有的、最具代表性的中国肉牛八大品种之一,耐粗饲、乳腺炎发病率较低。本试验试图比较三个牛群中C3基因单核苷酸多态性(SNP)差异,分析其与中国荷斯坦奶牛产奶性状的关联性,进而通过血清中C3浓度测定、补体活性测定、抗菌试验等一系列试验,验证相关性分析结果,初步阐明其抗性机理。本文扫描了中国荷斯坦牛、鲁西黄牛、渤海黑牛的C3基因前33个外显子区及5’侧翼区片段,发现了3个新的SNP位点,进一步分析了此三个位点在三个中国牛群中的多态性及其与中国荷斯坦奶牛产奶性状的相关性,在此基础上,进一步研究了其与354头中国荷斯坦奶牛的补体活性(CH50,ACH50)、C3浓度关联性,并通过对乳牛乳腺炎主要致病菌金葡菌和大肠杆菌的抑菌实验来验证我们的关联性分析结果。相关实验结果如下:采用巢式PCR和DNA测序方法,发现了三个新的SNP位点(g.-1293C>G, g.56T>C, g.7017C>T),已经提交至NCBI数据库中,SNPs登录号分别为ss289377982, ss289377985, ss289377986。SNP (g. -1293C>G)位于5’侧翼区,推测该区域及邻近区域可能对C3蛋白的表达调控和信号肽的表达起决定性的作用;SNP(g.56T>C)位于外显子1上,导致编码信号肽的第19个氨基酸从甲硫氨酸突变成苏氨酸;SNPs ( g.7017C>T)位于外显子12上,为无义突变,CAC (His) >CAT (His),仍编码C3蛋白beta链的第455位的组氨酸。通过CRS-PCR和PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism-PCR)方法,发现3个SNP位点(g.-1293C>G, g.56T>C, g.7017C>T)在中国荷斯坦牛、鲁西黄牛、渤海黑牛群体的优势等位基因相同,均为:C,T,C;其频率分别是83.5%/88.21%/76%,70.62%/85.85%/82%,82.89%/80.19%/80%。经χ2适合性检验,除g.-1293C>G位点在鲁西黄牛中没有达到Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05)外,三个位点g.-1293C>G, g.56T>C, g.7017C>T在三个牛群中均达到Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。中国荷斯坦牛和鲁西黄牛在g.-1293C>G位点,鲁西黄牛在g.56T>C位点、中国荷斯坦牛在g.7017C>T位点都表现为低度多态(PIC<0.25);其余则均表现为中度多态(0.25<PIC<0.5)。对具有3个泌乳记录的821头中国荷斯坦牛C3基因与体细胞数和产奶性状进行了相关性分析,在试验群体中三个位点共构建出8种单倍型,发现19种单倍型组合。关联性分析发现g.-1293C>G与乳蛋白含量存在显著相关性(P<0.05),而位点g.56T>C与SCS具显著相关性(P<0.05)。在单倍型组合中,H1H1(CCC/CCC)的奶牛个体其乳脂率和乳蛋白率显著要高于H1H8(CCC/GTT)的奶牛个体(P < 0.05),而H1H5(CCC/GCC)个体的SCS显著低于H1H8 (CCC/GTT)个体(P<0.01)。以奶牛乳腺炎主要致病菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为试验对象,选择单倍型组合为H1H5的个体作为乳腺炎抗性个体组,选择单倍型组合为H1H8的个体作为易感个体组,体外抑菌试验表明:易感组和抗性处理组的菌落数都显著高于未处理的抗性组个体(P<0.01);也进一步证实对乳腺炎的抗性与血清中的C3蛋白相关。因而,单倍型组合H1H1 (CCC/CCC)和H1H5 (CCC/GCC)可作为未来选择抗乳腺炎和高乳蛋白奶牛的分子标记。首次大规模测定了有足够血清的354头中国荷斯坦奶牛的血清中C3蛋白浓度和补体溶血活性,奶牛血清中C3浓度范围是1.1-48.9mg/mL;CH50范围是8.02-204.36 U/mL;ACH50范围是11.67-95.12 U/mL。分析了C3基因单个SNPs位点及其单倍型组合与血清中C3蛋白浓度和补体溶血活性的相关性。发现:位点g.56T>C与SCS(P<0.05)和ACH50(P<0.01)值都具有显著相关性,位点g.7017C>T与ACH50值有极显著相关性(P<0.01),上述结果表明SNP位点g.56T>C和g.7017C>T可作为补体活性性状的分子标记。单倍型组合为H2H4(CCT/CTT)的牛群比其他牛有更高的CH50值;H1H2 (CCC/CCT)比H1H3(CCC/CTC)和H3H7 (CTC/GTC)有显著高的ACH50值(P<0.01)。上述结果显示牛C3基因单倍型组合H1H2 (CCC/CCT)和H2H4 (CCT/CTT)可作为未来补体活性性状的分子标记。但我们试验结果仅是初步的,还需对C3基因5’侧翼区和C3蛋白浓度各个部分之间的相互关系和影响进行进一步的研究。