第一部分 SiRNA沉默酸性鞘磷脂酶基因 目的：为探讨用siRNA沉默酸性鞘磷脂酶基因(sphingomyelin phosphodiesterase1，SMPD1 or acid sphingomyelinase，ASM，ASMase)是否可以在体外保护生发泡期(germinal vesicle stage，GV stage)期卵母细胞免受化疗药物的损害，为开发有卵巢保护作用的RNAi类药物提供实验基础。本研究观察siRNA沉默小鼠成纤维细胞NIH3T3系和GV期卵子smpd1基因后对化疗药物诱导凋亡的反应，是研究国际上首次观察smpd1 siRNA沉默酸性鞘磷脂酶对卵子保护作用的研究。 方法：化学合成6条靶向smpd1基因mRNA不同位点的siRNA，用脂质体lipofectamine2000转染小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3。用荧光标记siRNA优化转染效率，于转染后不同时间用荧光定量RT—PCR法和western blot法检测smpd mRNA和SMPD1蛋白水平，筛选出有效siRNA序列并确定最低有效浓度和沉默基因所需要的时间。NIH3T3细胞转染筛选出的有效siRNA和对照无沉默效应siRNA72h后，培养液中加入丝裂霉素40μg/ml继续孵育24h诱导凋亡，Hoechest/PI双染荧光显微镜下观察及Annexin V—EGFP/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 分别收集GV期卵母细胞、受精卵从至囊胚各阶段胚胎固定后用于免疫荧光检测SMPD1的表达情况。GV卵培养液和操作液中添加0.2mM IBMX抑制GVBD，显微注射5pl siRNA、阴性对照RNA或溶解siRNA的缓冲液，培养6h、12h、24h和36h，用western blot检测SMPD1蛋白水平的基因沉默情况。根据蛋白沉默需要的时间卵子移离IBMX，同时在培养液中加入200nM表阿霉素诱导GV卵凋亡，观察卵形态。用共聚焦显微镜观察表阿霉素的细胞内蓄积情况，分别用annexin V/PI/Hoechst33342染色和单细胞凝胶电泳观察细胞膜及DNA的完整性。 结果：转染NIH3T3细胞后，用荧光定量RT—PCR方法筛选6条siRNA，发现3号传统19nt siRNA和stealth siRNA2号和3号均对3T3细胞smpd1 mRNA有明显抑制作用，分别为67.19％，78.9％和65.8％(转染效率约为90％)。使用40nM浓度最佳，SMPD1蛋白沉默的最佳时间72h。转染smpd1 siRNA对于丝裂霉素(mytomicin，MMC)诱导NIH3T3细胞的凋亡作用有显著的保护作用，转染siRNA3号组(8.6％)和stealth siRNA2号(7％)为凋亡率均显著低于对照组(31％)。说明丝裂霉素诱导NIH3T3细胞的凋亡与鞘磷脂通路有关。 免疫荧光示SMPD1分布于GV期卵了至囊胚细胞膜和细胞质中。靶向smpd1的siRNA显微注射到GV卵子的胞浆中后，SMPD1蛋白水平随注射时间而下降，24h SMPD1蛋白下降约90％。暴露于表阿霉素(EPI)40h后出现胞浆碎裂等退化表型。与未注射和注射阴性对照及缓冲液的卵子相比，注射smpd1 siRNA的卵子细胞内EPI蓄积明显少于对照GV卵。Annexin V/PI/Hoechst33342染色和单细胞凝胶电泳(彗星实验)方法发现注射siRNA可以对抗EPI产生的损伤作用，与smpd1基因敲除实验的结果一致。 [结论]：靶向Smpd1基因的siRNA沉默酸性鞘磷脂酶基因在小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3和GV期卵子中具有一定对抗化疗药物丝裂霉素和表阿霉素诱导凋亡的作用。Smpd1 siRNA可能成为对抗卵子化疗中凋亡的新方法。 第二部分肺癌分子病理分期研究 目的：即使是外科手术疗效较好的IB期非小细胞肺癌病人，5年生存率仅在70％左右，即约30％的病人在5年内死亡。目前的分期系统无法发现此类高危病人。本研究试图利用多个分子标记物组合来个体化预测IB期非小细胞肺癌的预后。 方法：对148例IB期非小细胞肺癌的癌组织进行了33种分子标记物的检测。然后利用其中73例病人的临床病理特征及预后资料，结合33种分子标记物的表达状态，用支持向量机方法筛选构建三种IB期非小细胞肺癌个体化预后预测模型。最后利用剩余的75例病人对以上三种模型进行了验证。 结果：构建了三种基于免疫组化和支持向量机的IB期非小细胞肺癌个体化预后预测模型，包括SVM1，SVM2和SVM3。SVM1由病人年龄、病理类型和5种分子标记物(CD34MVD、EMA、p21ras、p21WAF1和TIMP—2)构成。SVM2由病人年龄、病理类型和19种分子标记物(BCL2、caspase—9、CD34MVD、low—molecular—weight cytokeratin、high—molecular—weight cytokeratin、cyclooxygenase—2、EMA、HER2、MMP—2、MMP—9、p16、p21ras、p21WAF1、p27kip1、p53、TIMP-1、TIMP—2、VEGF和β—catenin)构成。SVM3则由SVM1和SVM2组合而成。单因素和多因素分析证明对于根治术后的IB期非小细胞肺癌，这三种SVM模型是独立的预后因子，并进一步在75例IB期非小细胞肺癌进行了个体化预后预测验证。SVM1将全组148例病人分为高风险组41例vs.低风险组107例，高风险组1、3、5年总的累计生存率分别是65.9％、22.0％和7.3％，低风险组1、3、5年总的累计生存率分别是95.3％、89.7％和88.7％。SVM1将验证组75例病人分为高风险组17例vs.低风险组58例，高风险组1、3、5年总的累计生存率分别是70.6％、29.4％和17.6％，低风险组1、3、5年总的累计生存率分别是93.1％、82.6％和80.8％。SVM2将全组148例病人分为高风险组50例vs.低风险组98例，高风险组1、3、5年总的累计生存率分别是72.0％、32.0％和17.1％，低风险组1、3、5年总的累计生存率分别是94.9％、90.8％和90.8％ SVM2将验证组75例病人分为高风险缰49例vs.低风险组26例，高风险组1、3、5年总的累计生存率分别是80.8％、46.2％和33.6％，低风险组1、3、5年总的累计生存率分别是91.8％、83.7％和83.7％。SVM3将全组148例病人分为高风险组50例vs.低风险组98例，高风险组1、3、5年总的累计生存率分别是71.7％、34.0％和20.0％，低风险组1、3、5年总的累计生存率分别是95.8％、91.6％和91.6％。SVM3将验证组75例病人分为高风险组29例vs.低风险组46例，高风险组1、3、5年总的累计生存率分别是79.3％、48.3％和37.1％，低风险组1、3、5年总的累计生存率分别是93.5％、84.8％和84.8％。 结论：构建的三种基于免疫组化和支持向量机的模型能够较好的实现IB期非小细胞肺癌的个体化预后预测。