研究背景溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis, UC)是一种反复发作的慢性非特异性肠道炎症,病变局限在结直肠粘膜层及粘膜下层,以腹痛、腹泻、粘液血便为主要临床特征,与克罗恩病(Crohn’s Disease, CD)同属于炎症性肠病(Inflammatory Bowel Diseases, IBD)。IBD主要多发于西方欧美等发达国家,但是随着生活方式的改变,其他国家的发病率在逐年增加,而在亚洲UC发病比CD更为普遍。遗憾的是,尽管目前的治疗手段能够减轻病理性肠道炎症,但是不能改变潜在的免疫紊乱或治愈该病,这样导致患者形成慢性、复发或者加重的状态。中医认为UC的致病因素是湿邪,与肠、肝、肾关系密切,疾病初起以实证为主而见湿热内蕴之候,久则伤脾及肾,入络,由于其病程长,病势缠绵,病变可及脏腑阴阳气血。其病位在肠,病在血分,活动期以湿热型最为多见;缓解期以本虚标实为多见,本虚为脾肾虚弱,标实为湿热。中医经典名方黄芩汤对于UC有良好的疗效,因此,合理开发天然药物复方或单体有望开辟一个治疗UC的新途径。UC的病因和机制仍不完全清楚,多认为遗传和环境因素的相互作用最终导致针对正常菌群组份的过度和失控的粘膜免疫反应是其主要病机。已有研究表明CD4+T细胞与UC的发病密切相关,Th1、Th2、Th17和Treg是其主要亚群。在趋化因子的作用下归巢至结肠是CD4+T细胞诱发UC局部免疫反应的重要步骤。T淋巴细胞的表面粘附分子控制其渗出进入淋巴或非淋巴组织,整合素在其中发挥重要作用,淋巴细胞粘附血管壁部分是由β1整合素(也称CD29)识别其配体VCAM-1控制的。有研究显示VCAM-1在DSS诱导的大鼠结肠炎中升高,免疫阻断后能够缓解肠炎,而我们前期的研究也发现湿热型肠炎大鼠结肠和湿热型UC患者结肠VCAM-1(CD29的配体)表达均升高,UC病变局限于结直肠可能与该部位VCAM-1的高表达并趋化CD4+CD29+T细胞有关。CD4+CD29+T细胞往往在再次免疫应答缺损疾病(如异位性皮炎和慢性肉芽肿病)中下调,而在急性丙型肝炎和牙龈炎等过度的炎症性疾病中比例升高。我们先前研究观察到湿热型UC患者和结肠炎模型大鼠外周血CD4+CD29+T细胞比例升高。因此,我们认为CD4+CD29+T细胞可能与UC的过度免疫反应有关。众所周知,UC是一种顽固的持续或反复复发的一种疾病,即使将UC或CD病变部位手术切除后,在肠道的其他部位仍会复发,而且肠外症状仍会持续存在。因此,有研究者认为长寿命记忆CD4+T细胞可能是导致IBD持续的主要原因。另外,以往多项研究表明以CD29作为记忆性细胞的标志物,并认为CD4+CD29+T细胞是记忆性CD4+T细胞的一种亚型,这些都反映出了,CD4+CD29+T细胞可能与UC的反复发作有密切的联系。由此可见,CD4+CD29+T细胞在UC复杂的免疫反应中扮演着重要角色,但其在UC中免疫作用的研究却极少,也未见到该类细胞在UC中与已知CD4+T细胞亚群之间关系的相关报道。CD4+CD29+T细胞究竟是独立与Th1、Th2、Th17和Treg的一种新CD4+T细胞亚群,还是在特定疾病中以某一或某些亚群为主的细胞群,仍不明确。目前,5-氨基水杨酸(5-amino salicylic acid,5-ASA)类药物是治疗UC的一线用药,60～70%的轻中度患者对其有临床反应。诱导缓解无效时,可加用激素以控制较为严重的症状。免疫抑制剂如环孢素-A(cyclosporine-A、CsA)、硫唑嘌呤类药物和新兴的生物制剂,如英夫利息单抗(infliximab, IFX)和阿达木单抗(Adalimumab, ADA)则用于激素难治性UC的治疗,取得一定效果。然而,这些药物均存在不同程度的胃肠道反应、感染、肿瘤等副作用,导致患者无法耐受,依从性降低。即使患者能够坚持长期用药,仍有部分患者的症状无法得到控制,导致反复复发,最终选择手术治疗。因此,UC的治疗在临床上仍然是一个棘手难题,亟需开发新的治疗途径。随着全球疾病谱和医疗模式发生重要变化,以及大量使用合成药带来的不良反应,开发利用中药、天然药物的呼声正在日益高涨,人们对天然药物维护健康或防治疾病充满了期望。黄芩苷是中药黄芩的主要有效成分,具有抗炎和调节免疫的作用,有研究表明黄芩苷能够有效抑制Th17细胞的扩增和限制其向肾脏炎症部位的迁移,并且能够抑制脐静脉内皮细胞VCAM-1的表达。说明黄芩苷能够抑制CD4+T细胞某一类或某一些亚群,并限制其迁移至炎症组织。然而,黄芩苷是否对UC患者外周血CD4+T细胞亚群的功能和分化产生影响,还未见相关报道。因此,积极完善相关研究,有利于开辟治疗UC的新途径。综上所述,CD29粘附和记忆的两个特性,切中UC病变局限在结直肠和反复发作的两个重要临床特点,研究CD4+CD29+T细胞的功能及其与Th1、Th2、 Th17和Treg的相互关系,有利于阐明UC反复持续发生的机理。另外,黄芩苷具有抗炎和免疫调节作用,探讨黄芩苷对UC患者外周血T细胞的作用,有望开发出安全有效治疗UC的天然药物。本研究拟从细胞数量、主要转录因子mRNA的表达、主要细胞因子在血清中的表达3个层面分析UC患者外周血各CD4+亚群的表达情况,同时对CD4+CD29+T细胞的数量及与CD4+T细胞各亚群之间的联系进行深入研究,有利于进一步完善UC的免疫学机制。我们同时对黄芩苷体外刺激UC患者外周血T细胞的作用及可能的作用机制进行探讨,对合理开发中药及开辟治疗UC的新途径提供理论依据。目的1.通过流式细胞术及Rt-PCR分析UC患者外周血单个核细胞中CD4+T细胞各亚群(即Th1、Th2、Th17和Treg)的比例,并用蛋白芯片筛查外周血中相关细胞因子的表达。2.了解UC患者外周血单个核细胞中CD4+CD29+T细胞的水平,并探讨与疾病严重程度的相关性；通过流式细胞术圈门技术,分析UC患者外周血CD4+CD29+T细胞水平与CD4+T细胞亚群的关系。3.黄芩苷对UC患者外周血单个核细胞进行体外干预,观察CD4+T细胞相关细胞因子和转录因子的变化情况,探讨黄芩苷对UC患者CD4+T细胞的作用及其作用机制。方法一、UC患者CD4+T细胞亚群及其相关细胞因子的表达1.入选标准及分组：研究纳入2012年9月至2013年4月来南方医科大学南方医院就诊的UC患者(n=26,14名男性,12名女性,年龄32.2±11.0岁)。入选标准参考2012年中华医学会消化病分会炎症性肠病学组会议通过的《我国炎症性肠病诊断与治疗的共识意见》。同时选21名健康者作为对照(13名男性,8名女性,年龄30.55±10.44)。2.结肠镜检查确定病变范围,并活检肠粘膜常规HE染色,观察组织病理学改变,同时对UC患者疾病活动指数(DAI)进行评分；3.在细胞表面标记物层面,用流式细胞术检测外周血PBMCs、CD4+T细胞亚群(Th1、Th2、Th17和Treg)匕例的改变,我们将IFN-T染色阳性的CD4+T细胞定义为Thl细胞,IL-4染色阳性的CD4+T细胞定义为Th2细胞。IL-17染色阳性的CD4+T细胞定义为Th17细胞。将CD4+CD25+Foxp3+阳性染色的细胞定义为经典Treg细胞。4.在转录因子层面,用Rt-PCR检测外周血PBMCs中CD4+T细胞亚群相关转录因子(T-bet、GATA-3、 RORc和FoxP3)的水平。5.在细胞因子层面,使用美国RayBiotech公司的人Th1/Th2/Th17抗体芯片(QAH-TH17-1)筛选血清中CD4+T细胞相关的细胞因子,并进行半定量分析。6.在微环境层面,使用Rt-PCR检测肠粘膜活检组织中IL-17、IL-23、 IL-10mRNA的变化。二、UC患者外周血CD4+CD29+T细胞与辅助性T细胞的关系1.入选标准及分组：研究纳入2013年7月至2013年9月来南方医科大学南方医院就诊的UC患者(n=16,10名男性,6名女性,年龄28.9±10.2岁)。入选标准参考2012年中华医学会消化病分会炎症性肠病学组会议通过的《我国炎症性肠病诊断与治疗的共识意见》。同时选16名健康者作为对照,男10名,女6名,年龄28.8±9.91岁。2.结肠镜检查确定病变范围,同时对UC患者疾病活动指数(DAI)进行评分；3.用流式细胞术,观察正常对照组和UC患者外周血中CD4+CD29+T细胞的水平,并分析其与DAI的相关性；4.通过流式细胞技术,以CD4+CD29+设门的基础上,比较UC患者和正常对照组CD4+IFN-γ+(Th1)、CD4+IL-4+(Th2)和CD4+IL-17+(Th17)的水平。三、黄芩苷体外刺激UC患者外周血单个核细胞对IL-23R/Jak2/Stat3通路的影响以中重度UC患者(n=52)和正常健康人(n=12)的外周血单个核细胞(PMBCs)为研究对象。UC的诊断标准及正常对照组的的选择同上。1.UC患者(n=12)和正常对照组(n=12)分离出的PBMCs,用Western Blotting检测UC患者和正常对照组IL23R、JAk-2、Stat-3和Smad蛋白的相对表达水平；2.UC患者分离出PBMCs后,用不同浓度黄芩苷进行刺激培养,细胞培养分组：UC患者(n=44)分离出的PBMCs用于黄芩苷的刺激培养实验,共分为4个组：①对照组(Control组)：DMSO+抗-CD3+抗-CD28刺激组；②黄芩苷低浓度组(BL组)：5μmol黄芩苷+DMSO+抗-CD3+抗-CD28刺激组；③黄芩苷中浓度组(BM组)：20μmol黄芩苷+DMSO+抗-CD3+抗-CD28刺激组；④黄芩苷高浓度组(BH组)：40μml黄芩苷+DMSO+抗-CD3+抗-CD28刺激组。其中DMSO,即二甲基亚砜,为黄芩苷的溶剂；3.用Rt-PCR,观察不同浓度黄芩苷对RORc mRNA的表达和IL-17mRNA的表达的影响；4.用Western Blotting技术,比较不同浓度黄芩苷对IL-23R、JAK2蛋白表达的影响；5.用Western Blotting技术,比较不同浓度黄芩苷对STAT3和Smad蛋白磷酸化的影响；统计学分析本实验采用SPSS16.0统计处理软件进行统计分析。常规进行方差齐性检验,正态性检验。计量资料实验数据以均数土标准差(x±s)表示,单变量两组资料之间的比较采用t检验,多组资料之间的比较采用单因素方差分析。方差齐时,多重比较采用LSD法,方差不齐时进行Welch法校正,采用Dunnett’sT3法进行组间多重比较。正态分布资料的相关分析采用Pearson相关分析。以a=0.05作为检验水准,P<0.05为差异具有统计学意义。实验结果一、UC患者CD4+T细胞亚群及其相关细胞因子的表达1.实验纳入的UC患者肠镜下表现和HE染色组织病理学特点符合UC的诊断标准；2.UC患者外周血Th1(CD4+IFN-γ+)、Th2(CD4+IL-4+)细胞的比例,与对照组相比,差别无统计学意义(t=1.791P=0.095和t=1.174,P=0.260)。Thl7细胞在UC患者外周血中的比例高于对照组,差异具有统计学意义(t=3.421,P=0.008)。而UC患者外周血Treg细胞比例,低于对照组,差异具有统计学意义(t=2.954,P=0.010)；3.UC患者PBMCs中T-bet和GATA-3mRNA的表达与对照组无明显差别(t=1.195, P=0.246; t=0.310, P=0.760)。RORc mRNA的表达高于对照组,差别有统计学意义(t=2.721,P=0.013)。而Foxp3mRNA的表达则低于对照组,差别有统计学意义(t=3.610,P=0.002)；4.使用蛋白芯片发现,在正常对照组和UC组外周血血清中,发现4个有差异的细胞因子,IL-2、IL-10、IL-21和IL-23,他们在UC组的水平均高于对照组,差异均有统计学意义(t=5.631,P<0.001;t=4.539,P<0.001; t=4.767,P<0.001; t=4.639,P=0.001);5.UC患者炎症部位活检组织、非炎症部位和对照组间IL-17、IL-23mRNA的表达差异有统计学意义(F=21.329, P<0.001; F=11.565, P<0.001),其中炎症部位IL-17、IL-23均高于非炎症部位(P<0.001,P<0.001)和对照组(P=0.002,P<0.001),差别具有统计学意义,IL-17、IL-23在非炎症部位与对照组差别无统计学意义(P=0.238,P=0.250)。但IL-10mRNA水平在UC患者炎症部位、非炎症部位和对照组三者间差异无统计学意义(F=0.058,P=0.944)。二、UC患者外周血CD4+CD29+T细胞与辅助性T细胞的关系1. CD4+CD29+T细胞在UC患者外周血中的比例高于对照组,差异具有统计学意义(t=7.142,P<0.001)；2.UC患者外周血CD4+CD29+T细胞水平与其DAI评分呈正相关(r=0.973,P<0.001),相关系数有统计学意义；3.流式分析发现在CD4+CD29+T细胞中,UC患者和正常对照组相比,IFN-y,IL-4的表达水平差异无统计学意义(t=1.619, P=0.119; t=0.526, P=0.640)。然而,IL-17的表达,在UC患者中高于正常对照组,差别有统计学意义(t=3.876,P=0.001)。三、黄芩苷体外刺激UC患者外周血单个核细胞对IL-23R/Jak2/Stat3通路的影响1.与正常对照组相比,UC患者IL-23R, Stat-3的表达升高,差异具有统计学意义(t=5.787, P<0.001; t=3.486, P<0.006)。而Smad的表达降低,差异具有统计学意义(t=2.827, P=0.018)。Jak-2的表达差异无统计学意义(t=0.639,P=0.537)。2. Control组、BL组、BM组、BH组间RORc、IL-17mRNA表达的差异有统计学意义(F=21.080,P<0.001和F=9.854,P<0.001)。BL组与Control组相比,RORc、IL-17mRNA的表达水平差异无统计学意义(P=0722, P=0.143)。而BM.BH组RORc mRNA的表达,低于对照组,差异具有统计学意义(P=0.001,P<0.001),BM、BH组IL-17mRNA的表达,低于对照组,差异具有统计学意义(P=0.002,P<0.001)。3.Control组、BL组、BM组、BH组间IL-23R、JAK-2蛋白表达的差异有统计学意义(F=9.142,P=0.006和F=6.910,P=0.013)。BL组与Control组相比,IL-23R、JAK-2的表达水平差异无统计学意义(P=0.376,P=0.513)。而BM、BH组IL-23R的表达,低于对照组,差异具有统计学意义(P=0.022,P<0.001),而BM、BH组JAK-2的表达,低于对照组,差异具有统计学意义(P=0.040,P=0.003)。4. Control组、BL组、BM组、BH组间p-stat3表达的差异有统计学意义(F=21.047,P<0.001)。BL组与Control组相比,p-stat3的表达水平差异无统计学意义(P=0.08)。而BM、BH组p-stat3的表达,低于对照组,差异具有统计学意义(P=0.033,P<0.001)。四组间p-smad表达的差异有统计学意义(F=8.516,P=0.007)。BL组与Control组相比,p-smad的表达水平差异无统计学意义(P=0.534)。而BM、BH组p-smad的表达,高于对照组,差异具有统计学意义(P=0.043,P=0.002)。结论1.UC患者外周血中Thl7细胞及其主要转录因子RORc mRNA表达水平较对照组明显升高,而Treg细胞及其特异性转录因子Foxp3mRNA表达水平则明显降低,同时发现维持Th17细胞扩增和稳定性的IL-21、IL-23水平也升高,提示UC患者外周血存在Th17/Treg失衡,可能与UC的发病机制有关；2.UC患者炎症部位肠粘膜IL-17、IL-23mRNA高于非炎症部位和对照组,提示IL-23/IL-17通路参与维持Th17致病性；3.UC患者外周血中记忆性CD4+CD29+T细胞的数量增多,且与DAI呈正相关,提示其与UC的发病密切相关;4.UC患者记忆性CD4+CD29+T细胞表面IL-17的表达增多,提示Th17(CD4+IL-17+T)细胞可能是导致UC反复发作的主要“记忆性致病细胞”；5.UC患者PBMCs中IL-23R、Jak-2、Stat-3的表达明显升高,提示IL-23R/Jak2/Stat3通路参与了UC的发生。6.黄芩苷能够抑制UC患者PBMCs中RORc和IL-17A的表达,提示黄芩苷能抑制Thl7的功能,其作用可能是通过下调IL-23R和Jak2,抑制Stat3的磷酸化,上调Smad的磷酸化水平来实现的。