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本论文主要涉及了三个蛋白的基因克隆表达及相关抑制剂筛选的研究,主要包括与糖尿病综合症及炎症相关的醛糖还原酶和醛还原酶,以及一种具有脑靶向作用的多亚基全新的霍乱毒素类似嵌合蛋白的基因克隆表达和纯化,及采用醛糖还原酶和醛还原酶进行抑制剂的筛选,主要得到的结果有以下三种。第一,醛糖还原酶(Aldehyde reductase AKR1B1, EC1.1.1.21)是醛酮还原酶家族成员,是多元醇通路的关键限速酶。越来越多的研究发现,AKR1B1与多种疾病有关,在一系列的炎症性疾病等中起着关键作用,与多种炎症介质的产生有直接的关系,可作为筛选非甾体抗炎药物的新靶点。为了筛选相应的酶抑制剂,为药物开发及临床应用提供参考,本研究构建了重组表达质粒pET-22b-AKR1B1-(His)6,将该质粒转化至Rosetta(DE3)宿主菌中,通过对表达条件的优化,确定表达条件为0.175 mMIPTG、14℃、80 rpm诱导14h,重组蛋白以可溶和沉淀两种形式表达。采用亲和纯化得到纯度为93%的AKR1B1-(His)6融合蛋白。使用Western blotting蛋白质进行鉴定,蛋白质序列分析仪测定氨基酸序列片段与目的蛋白序列比对。利用体外酶动学方法测定AKR1B1-(His)6的比活力为(9.4±0.23)U/mg。使用该蛋白建立醛还原酶抑制剂筛选方法,分别测定已上市的13种非甾体抗炎药(Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs,NSAIDs)对AKR1B1-(His)6的抑制活性。结果表明,萘普生、双氯芬酸、氟灭酸、布洛芬等对融合蛋白AKR1B1-(His)6有较强的抑制作用,可与抗糖尿病并发症药物联合用药。醛还原酶(Aldehyde reductase AKR1A1, EC 1.1.1.2)是醛酮还原酶家族成员,能将有毒醛还原成相应的醇。为研究非甾体抗炎药对AKR1A1的抑制作用,为非甾体抗炎药的副作用及临床应用提供参考,本研究构建了重组表达质粒pET-22b-(His)6-DDDD K-AKR1A1,将该质粒转化至Rosetta(DE3)宿主菌中,通过对表达条件的优化,确定表达条件为0.25 mMIPTG,16℃,80 rpm诱导14h,重组蛋白以可溶形式表达。采用亲和纯化得到纯度为90%的pelB-(His)6-DDDDK-AKR1A1融合蛋白。重组蛋白用肠激酶特异性剪切,经过Ni-NTA、Sephadex G-75再次纯化,得到纯度为98%的野生型AKR1A1蛋白。使用Western blotting和蛋白质序列分析对蛋白质进行鉴定。利用体外酶动学方法测定(His)6-DDDDK-AKR1A1的比活力为(41.3±0.1)U/mg、AKR1A1比活力为(79.4±0.15)U/mg。奥沙普秦、酮基布洛芬、氟灭酸、托芬那酸等对AKR1A1有很强的抑制作用,为抗炎药副作用提供参考。为了得到一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质,本研究还使用原核共表达系统,设计表达了一种全新的霍乱毒素类似嵌合蛋白。分别获得重组质粒pET-28a-CTB和pET-22b-EGFP-CTA2-TAT,利用pET-28a-CTB和pET-22b-EGFP-CTA2-TAT二者不同抗性,将双质粒分步转化到大肠杆菌BL21中。优化表达条件后,重组嵌合蛋白能以可溶形式表达。经过Ni-NTA、Sephadex G-75纯化,Western blotting对蛋白质进行鉴定,确定获得(CTB)5/EGFP-CTA2-TAT嵌合蛋白,为该蛋白进一步的入脑研究提供了物质基础。