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H9N2亚型低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus,LPAIV)在世界范围内广泛流行,并且可以感染人类以及低等的哺乳类动物。临床上感染了H9N2禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的鸡常表现为肉鸡生长发育迟缓、蛋鸡产蛋下降,但是值得注意的是,当此病毒继发感染禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)时会造成禽类的伤亡率大幅的增加,给养禽业造成了很大的经济损失。尽管病毒感染后造成的组织损伤会为细菌的入侵提供机会,但是有研究者证明,对于低毒力菌株这种机制并不充分。后来经过一些研究者的研究发现,低毒力毒株继发感染细菌的原因是宿主下呼吸道上皮细胞发生了某种改变从而暴露或激活了某种受体蛋白,从而使细菌更容易粘附于宿主的细胞上。因此,本研究以临床分离的并发感染的H9N2亚型AIV和大肠杆菌为研究对象,从宿主因素探寻病毒和细菌继发感染之间的关系。本研究分为以下三部分内容:1.H9N2 AIV对大肠杆菌粘附宿主的影响将鸡胚成纤维细胞(CEF)和DF-1两种细胞分别培养在3个6孔细胞板上至长成单层,每个细胞板中选择其中3个细胞孔接种H9N2病毒,另外3个未感染病毒孔作为对照。每隔24 h选一个细胞板,在此细胞板的6个细胞孔中都接种APEC,4℃孵育1.5 h后,将细胞刮下后涂布法测定APEC的数量,结果发现感染了病毒的细胞中大肠杆菌的粘附数量显著高于未感染病毒的细胞,且在72 h时细菌粘附在病毒感染细胞的数量是未感染细胞的2倍多,瑞氏染色也证明了这个结果。在体内试验中,将30只5周龄的SPF鸡饲喂在无菌隔离器中,15只鸡经鼻接种H9N2病毒,分别于接种后每隔24 h随机选择3只鸡并置于新的隔离器中,鼻腔接种APEC菌液作为试验组。另外15只无病毒感染的只接种APEC的SPF鸡作为对照。取试验组和对照组的鸡肺脏组织进行组织切片免疫荧光染色和苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE),分别鉴定病毒感染和病理损伤情况,并将肺组织研磨液涂布于LB平板上记录菌落个数,发现在72 h时粘附到病毒感染肺的大肠杆菌数量显著高于粘附到未感染病毒的肺并且细菌粘附数量以时间依赖性增加,组织切片免疫荧光染色结果显示鸡肺具有高病毒载量,然而,HE染色结果表明,在病毒感染和正常肺之间没有观察到显著的病理学差异。体外体内试验表明H9N2病毒有利于大肠杆菌对宿主的粘附且大肠杆菌的数量以时间依赖性增长,并且由于病毒感染引起的细菌粘附的增加与病理损伤之间没有必要的联系。2.蛋白质组学iTRAQ分析本研究构建了晚期鸡胚感染模型,并用蛋白质组学分析筛选宿主上与大肠杆菌粘附有关的蛋白质。通过同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)与液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)相结合分析发现共有279个差异表达蛋白,其中,上调蛋白233个,下调蛋白46个,我们重点研究了上调蛋白中与细菌粘附有关的转化生长因子-β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)蛋白。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因和基因组百科全书)富集分析结果表明差异表达蛋白主要在病原致病性相关信号通路,细胞增殖、分化、凋亡,宿主先天免疫通路中富集。3.TGF-β1毕赤酵母阳性转化子的构建,表达及初步功能验证根据GenBank中鸡TGF-β1的基因序列设计并且合成特异性引物,模板是提取感染了H9N2病毒的鸡肺脏组织RNA的反转录产物,用合成的引物借助PCR技术来扩增TGF-β1。目的片段与pMD18-T载体相连接,将测序成功的pMD18-T-TGF-β1载体用Xho I和EcoR I两种限制性核酸内切酶对其双酶切,将胶回收后的目的基因与pPIC9表达载体连接后线性化重组表达载体,将线性化的重组表达载体pPIC9-TGF-β1及作为阴性对照的空质粒pPIC9转化到毕赤酵母细胞中,通过用RDB板筛出阳性的转化子并利用PCR技术及基因测序鉴定。对阳性转化子、空质粒阴性对照转化子利用甲醇诱导表达。经SDS-PAGE及Western blot技术对蛋白质的表达进行鉴定,SDS-PAGE的凝胶中有一条与目的蛋白分子量大小一致的44.5 kDa的条带,阴性对照孔里并没有此条带。纯化后的蛋白在SDS-PAGE凝胶中只检测到一条大小为44.5 kDa的蛋白条带。Western blot分析中也有大小为44.5 kDa的特异性条带,与SDS-PAGE的鉴定结果一样。向体外培养的CEF和DF-1细胞中添加表达出的目的蛋白,然后接种APEC,孵育、离心、洗涤后,检测粘附在细胞上的APEC数,结果发现添加了外源TGF-β1蛋白的细胞上粘附的大肠杆菌数量比未添加TGF-β1蛋白的细胞多,并且细菌数量随TGF-β1蛋白剂量的增加而增加。这些研究结果表明H9N2 AIV感染后有利于APEC对宿主细胞的粘附,并且TGF-β1宿主蛋白与APEC的粘附有关。