疾病状态下,体内微环境的改变、内源性物质的浓度变化等可能导致药物的代谢酶、转运体的活性发生变化,从而使得药物的血浆暴露量、清除等药动学特征与健康人不同,如抗高血压药依那普利在肾功能不全患者中的血浆暴露量显著增加,因此需要临床剂量的调整以防止不良反应的发生。阐明药物及代谢物在肾功能不全状态下药动学改变的机制,对药物的临床前及临床研究均有重要的指导意义。本文以硝基咪唑类抗菌药吗啉硝唑、氰基吡咯烷类二肽基肽酶-4（Dipeptidyl peptidase-4,DPP-4）抑制剂维格列汀为研究对象,系统研究了慢性肾功能不全（Chronic renal failure,CRF）对原形药物及代谢产物药动学的影响,进一步探讨了肾功能不全对有机阴离子转运体（Organic anion transporter,OAT）底物药动学的影响机制,为特殊人群的合理用药及治疗方案提供理论基础。1.慢性肾功能不全影响吗啉硝唑及其结合型代谢物药动学的机制研究吗啉硝唑是新型硝基咪唑类抗菌药,临床上以消旋体给药。静脉注射后,吗啉硝唑在人体内的主要代谢途径是N⁺-葡萄糖醛酸结合形成M8-1（S-吗啉硝唑的N⁺-葡萄糖醛酸结合物）、M8-2（R-吗啉硝唑的N⁺-葡萄糖醛酸结合物）,以及硫酸结合形成M7;主要经过肾脏消除,尿中的原形及结合型代谢物M8-2、M7、M8-1分别占剂量的21.2%、28.4%、13.0%、6.6%。与健康受试者相比,重度肾功能不全患者静脉注射相同剂量的吗啉硝唑,原形血浆暴露量增加50%,而结合型代谢物M7、M8-1、M8-2的血浆暴露量分别是健康受试者的15.1、20.4、17.4倍。已有实验证明M7是肾脏摄取转运体OAT1和OAT3的底物,M8-1和M8-2是OAT3的底物。本研究目的在于阐明慢性肾功能不全对吗啉硝唑及其结合型代谢物药动学影响的机制。采用两步法手术建立5/6肾切除（5/6 Nephrectomy,5/6 Nx）慢性大鼠模型,生化指标及肾脏病理切片结果表明建模成功。化学合成吗啉硝唑硫酸结合物M7,直接评价M7在5/6 Nx组大鼠和正常大鼠体内的药动学差异。与对照组相比,M7在5/6 Nx组大鼠体内消除显著减慢,平均驻留时间增加为3.05倍,AUC_0-t增加到3.61倍,清除率降低为27.8%。采用qRT-PCR技术测定了两组大鼠肾脏中Oat1和Oat3的mRNA表达量。结果显示,5/6 Nx大鼠肾脏中的两种转运体的mRNA均显著降低为对照组的约50%,M7的AUC_0-t变化与两种转运体的mRNA的水平均呈中等程度负相关性。吗啉硝唑三种结合型代谢物（M7、M8-1和M8-2）在两组大鼠的新鲜肾切片的摄取未表现出差异,表明慢性肾功能状态对转运体表达的改变并没有对转运体活性产生显著的影响。蛋白结合类尿毒素硫酸吲哚酚（Indoxyl sulfate,IS）、马尿酸（Hippuric acid,HA）的血浆和肾中的浓度在5/6 Nx组大鼠体内显著升高。5/6 Nx组大鼠血浆和肾脏中IS分别是对照组的4.93倍和5.67倍,HA分别是对照组的4.87倍和6.85倍。M7的AUC_0-t与IS的血浆浓度具有高度相关性,与HA的血浆浓度具有中等程度相关性。另一蛋白结合类尿毒素吲哚-3-乙酸（Indole-3-acetic acid,IAA）在两组大鼠的血浆和肾中浓度无差异,且M7的AUC_0-t与其血浆浓度无相关性。体外肾切片结果显示,IS、HA及它们的混合溶液对M7、M8-1和M8-2在正常大鼠肾切片的摄取均有抑制,抑制程度随浓度的增加而增加,进一步验证了尿毒素抑制吗啉硝唑结合型代谢物在大鼠肾脏的摄取过程。在CRF患者血浆中,除了IS、HA和IAA显著增加外,蛋白结合类尿毒素3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸（3-carboxy-4-methyl-5-propyl-2-furanpropanoic acid,CMPF）也有显著的升高。转运体过表达细胞的体外抑制结果显示,CMPF、HA、IS这些蛋白结合类尿毒素对M7、M8-1、M8-2在OAT3中的摄取具有较强的抑制作用。在OAT3过表达的细胞中,CMPF对三种结合型代谢物M7、M8-1、M8-2的抑制作用最强,IC₅₀分别为19.2μM、8.53μM、6.75μM,远低于在肾功能不全患者体内的血浆浓度（250μM）。HA抑制的IC₅₀分别为87.4μM、39.4μM、24.1μM,IS抑制的IC₅₀分别为222μM、161μM、78.3μM,均低于或接近于在肾功能不全患者体内的浓度（HA,1400μM;IS,210μM）。IAA抑制的IC₅₀均高于其在肾功能不全患者体内的浓度（52μM）,说明IAA的抑制作用较弱,对三种结合型底物的肾排泄影响较小。以上结果表明在CRF患者体内,高浓度水平的CMPF、HA、IS会抑制三种结合型代谢物肾排泄过程,导致血浆暴露量升高。尿毒素CMPF、HA、IS、IAA对OAT1摄取M7的抑制作用较弱,IC₅₀值相对偏高,分别为200μM（IS）、187μM（CMPF）、162μM（HA）、197μM（IAA）。这一结果解释了M7虽然是2种转运体OAT1和OAT3的底物,但是其在CRF患者中的药动学变化却与仅为OAT3底物的M8-1和M8-2的药动学变化程度相似的原因。丙磺舒是多篇文献报道的典型OAT抑制剂,体外结果已经表明,丙磺舒可抑制M7在肾脏转运体中的摄取。为了验证转运体被抑制是否会对M7的药动学产生影响,对大鼠提前15 min注射丙磺舒后,静脉注射不同剂量的M7。在丙磺舒的抑制作用下,低、中、高三个剂量的M7的血浆暴露量变化相似,均增加到3倍左右。这也与5/6 Nx组大鼠尾静脉注射M7的血浆暴露量变化接近。表明体内转运体受抑制后,药动学变化与肾功能不全大鼠的药动学变化一致。综上所述,尽管5/6 Nx大鼠肾脏摄取转运体Oat1和Oat3的mRNA表达量有所降低,但其活性并没有被影响。但肾功能不全导致内源性蛋白结合类尿毒素IS、HA、CMPF（仅在人体中测得）的水平增加,其对OAT3的抑制导致底物吗啉硝唑结合型代谢物的肾排泄被抑制,血浆暴露量增加。因此,提示在疾病状态下,我们不应只是关注转运体或代谢酶的表达量变化,还应该考虑内源性的化合物对这些转运体或代谢酶的直接影响。2.慢性肾功能不全影响维格列汀及其羧酸代谢物药动学的机制研究维格列汀是氰基吡咯烷类DPP-4酶抑制剂,在体内主要代谢为羧酸,经肾脏排泄。文献报道维格列汀在不同肾功能不全患者中,AUC增加了32%至134%,C_max增加8%至66%。维格列汀的羧酸代谢物在轻度、中度、重度肾功能不全及终末期肾病（End-stage renal disease,ESRD）患者中分别增加了1.6倍、2.4倍、5.4倍及6.7倍。本实验的目的是采用5/6 Nx大鼠模型,结合肾切片和转运体等体外实验,阐明慢性肾功能不全影响维格列汀及其羧酸代谢物药动学的机制。转运体过表达细胞的体外实验结果表明,维格列汀不是肾摄取转运体OAT1、OAT3和有机阳离子2（Organic cation transporter 2,OCT2）的典型底物,但维格列汀羧酸代谢物是OAT3的底物。OAT3对维格列汀羧酸代谢物的摄取表现出时间和浓度依赖性,摄取动力学特点符合饱和摄取动力学,K_m为128μΜ,V_max是186 pmol/min/mg protein,摄取清除率V_max/K_m是1.45μL/min/mg protein。5/6 Nx大鼠灌胃给予维格列汀后,原形药物的血浆暴露量仅增加了45.8%,而其羧酸代谢物的血浆暴露量是对照组的7.51倍,药动学特征的改变与慢性肾功能不全患者的变化相似。维格列汀羧酸代谢物在5/6 Nx大鼠的排泄总量略有增加（约为剂量的10%）,可能由于肝脏中维格列汀代谢为羧酸的过程略有升高,但由于增加的程度较小,不是导致羧酸代谢物血浆暴露量大幅度增加的主要原因。直接静脉给予羧酸代谢物,其在5/6 Nx大鼠中的清除率显著降低至30.1%,平均驻留时间延长至2.25倍,血浆暴露量显著增加至3.34倍。表明维格列汀羧酸代谢物在肾功能不全大鼠的肾清除减慢导致其血浆暴露量增加。采用5/6 Nx组和対照组的肾切片考察了维格列汀羧酸代谢物摄取的情况。两组大鼠肾切片在37°C下的摄取明显高于在4°C时的摄取,进一步证明了羧酸代谢物在肾脏中的摄取有主动转运的参与。随着浓度的增加和时间的延长,维格列汀羧酸代谢物的肾摄取均有所增加,但是在各个浓度水平和时间点,两组大鼠的肾切片摄取情况均没有显著性差异。表明虽然在5/6 Nx大鼠肾脏中转运体的表达有所降低,但是最终并没有表现出对维格列汀羧酸代谢物肾摄取的差异。5/6 Nx组大鼠血浆中尿毒素IS和HA的浓度是对照组的4倍左右,且二者的血浆浓度均与羧酸代谢物的血浆暴露量有较高的相关性。将IS、HA单独或混合与维格列汀羧酸代谢物在正常大鼠肾切片孵育,均可浓度依赖性的抑制该底物的肾摄取。这一摄取可同样被OAT3的阳性抑制剂丙磺舒所抑制。以上结果说明,肾功能不全大鼠体内升高的尿毒素可抑制维格列汀羧酸代谢物的肾摄取。尿毒素的抑制作用在转运体OAT3过表达的HEK293细胞中被进一步证明。CMPF、IS、HA、IAA四种尿毒素的混合体系显示了对OAT3摄取维格列汀羧酸代谢物的较强的抑制作用,最低浓度（10、10、10、1μM）的混合尿毒素的抑制可达到63.7%,当混合尿毒素的浓度增加为30、30、30、3μM及以上时,对摄取的抑制达到90%以上,与OAT3的强阳性抑制剂丙磺舒的抑制作用类似。分别考察每种尿毒素的抑制作用,CMPF表现出的抑制作用最强,IC₅₀值为5.75μΜ,明显低于CMPF在肾功能不全患者血浆中的平均浓度250μM。HA、IS同样显示了一定的抑制作用,IC₅₀值分别为29.0μΜ和69.5μΜ,低于肾功能不全患者血浆中的平均浓度1400μΜ和210μΜ。以上结果表明,肾功能不全患者体内蓄积的尿毒素会强烈抑制维格列汀羧酸代谢物在肾近端小管上皮细胞中的摄取,进而抑制肾脏对其的排泄作用,最终导致血浆暴露量显著增加。结合Dixon图和Cornish-Bowden图的特点,推测IS、CMPF和HA三种蛋白结合类尿毒素的抑制类型均为混合性抑制。体外结果已经表明,丙磺舒可抑制维格列汀羧酸代谢物在肾脏转运体和肾切片中的摄取。为了验证转运体被抑制是否会对维格列汀羧酸代谢物的药动学产生影响,在丙磺舒给药后的大鼠体内,静脉给予维格列汀羧酸代谢物进行考察。结果表明,丙磺舒对转运体的抑制显著降低了维格列汀羧酸代谢物的清除（0.91 vs0.66 L/h/kg）,导致体内的血浆暴露量增加（1.59 vs 2.25μg?h/m L）。抑制作用与体外结果一致。综上所述,肾功能不全对维格列汀的药动学影响程度较小,可能是由于肾小球滤过率的降低所导致。羧酸代谢物的血浆暴露量随着肾功能不全的严重程度增加而升高,主要原因与它是OAT3底物有关。虽然慢性肾功能不全大鼠中Oat3的表达量有所下降,但并不影响维格列汀羧酸代谢物的肾摄取过程。而HA、IS、CMPF（只在人体中检测到）等蛋白结合类尿毒素在慢性肾功能状态下的累积,直接抑制了肾摄取转运体OAT3对维格列汀羧酸代谢物的摄取,导致其肾清除减慢,可能是导致维格列汀羧酸代谢物的血浆暴露量增加的主要原因。3.结论本文证明了蛋白结合类尿毒素对肾脏转运体底物药动学改变的重要作用。慢性肾功能不全状态下,体内增加的蛋白结合类尿毒素IS、HA、CMPF对肾摄取转运体OAT3表现出了较强的抑制,但对OAT1抑制较弱,可能是导致OAT3底物的血浆暴露量大幅度增加的主要原因,如本文研究的吗啉硝唑结合型代谢物、维格列汀羧酸代谢物。而非转运体底物吗啉硝唑和维格列汀在肾功能不全患者中的药动学变化程度较小。本研究结果提示我们,在疾病状态下,不应只关注转运体或代谢酶的表达变化,还应该考虑内源性物质改变对转运体和代谢酶活性的作用。由于这类尿毒素的蛋白结合程度高,不易被常规透析清除。因此,对于有机阴离子的药物及代谢物,尤其是OAT3的底物,临床应用时需要考虑其在慢性肾功能不全患者中肾清除减慢、血浆暴露量增加对药物安全性和有效性的影响,防止不良反应的发生。本文也提示在临床上如果这类尿毒素可以被清除,那么有机阴离子药物及代谢物在肾功能不全患者体内的药动学改变可能会发生逆转。