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药物性肝损伤（drug induced liver injury,DILI）是指处方药、非处方药或者中草药导致的肝脏损伤,临床上表现为各类急慢性肝脏疾病,严重者可直接导致急性肝衰竭甚至是死亡,是常见的药物不良反应。DILI不仅严重危害用药者的健康,还是药物研发失败、限制使用、撤市的主要原因。因此,DILI一直是新药研发企业、监管机构及临床医生严密关注的重要问题。近十余年来,虽然,在现代生命科学、计算机、生物信息学等技术的助力下,科学家们尝试建立了各种体外肝毒性测试预测系统,包括各种以体外人源肝细胞为主的生物学测试模型和整合药物各种信息的计算机模型,并将各种生命组学技术应用其中。然而,DILI机制的认识的不足和体外类生理化模型的技术局限性,使得现有的预测模型还无法准确预测DILI,特别是IDILI的药物,也没有一种适于新药研发早期候选药物肝毒性筛选,并被业界和监管机构广泛接受和许可。基于2D细胞的HCA技术能在单次实验获得受试药物毒性相关的机制与效应的多维信息,是发展新型体外药物肝毒性预测方法最受青睐的技术之一。截止目前,基于HCA的肝毒性测试方法是唯一经过批量药物验证、适于新药研发早期候选药物肝毒性筛选的方法。然而,该方法的测试指标并未经过系统的筛选、仅限于几个与临床DILI因果关系不甚明确、简单的毒性或机制相关的指标,并且建模时药物的选择与分类的标准也不一致,严重影响了模型方法的可信性。鉴于基于HCA的细胞表型谱测定可以获得大量机制相关参数的信息,既可以提供更丰富内涵的肝毒性测试指标,也可以通过机制模式/类别（pattern）的识别进行受试化合物的毒性分类排序,还不受制于DILI毒理学机制认识缺乏和体外模型羁绊,因此,本课题拟通过批量肝毒性药物肝细胞毒表型谱的系统分析,构建一个全新的基于2D人源细胞HCA、适合药物发现早期阶段、高效的DILI药物识别和预测的体系,为降低新药研发成本、提高新药研发效率提供支撑技术。本课题首先通过文献调研和国内外肝毒性数据库的信息搜索,选取了涉及各类适应征、临床DILI程度不同的药物223个,收集药物的化学结构SMILES表达式、脂溶性系数log P值、每日服药剂量、体内Cmax、DILIrank数据库中分类、在livertox数据库中的“可能性分值”、损伤类型等信息构建药物信息库,并参考DILIrank和livertox数据库分类标准,将受试药物分为严重（s DILI）、中等（m DILI）、不明确a DILI)和非（n DILI）肝损伤四类。并根据建模和验证的需求,将受试药物随机分为测试集（120个药物,包括50个s DILI、50个m DILI和20个n DILI药物）和验证集（103个药物,31个s DILI、31个m DILI、30个a DILI和11个n DILI药物）两组。然后,采用HCA技术先后测定测试集和验证集药物对细胞毒全表型谱的影响,包括1)细胞适应性应激反应参数（细胞自噬相关蛋白LC3B,氧化、内质网、缺氧和炎性应激通路转录因子Nrf2、ATF6、Hif1α和NF-κB）;2)共性细胞毒机制及毒性终点效应参数（DNA损伤、氧化损伤相关蛋白p H2AX、Mn SOD,核膜通透性（NMP）、GSH、线粒体膜电位（MMP）、细胞抑制率）;3)亚细胞器和细胞骨架参数（细胞核形态大小、溶酶体、细胞骨架F-actin和α-tubulin）等不同时间时间点的共计23个表型参数。计算受试药物对参数影响的EC50、LEC和效应值,并以体内最大血药浓度Cmax进行校正,构建药物细胞表型谱数据库。在此基础上,采用两种策略构建预测体系:1)基于测试集药物的细胞表型参数数据,首先排除假阳性高的表型参数,然后再采用基于机器学习的Tclass分类系统进行最优表型参数测试组合的筛选与识别;选择预测精度、稳定性以及ROC分析相关性最高的测试组合并形成一个软件系统,再用验证集药物获得的表型数据进行验证,最终获得了由7或13个表型参数组成的测试组合,方法的敏感性不低于80%,特异性为94%。对于7参数组成的模型可通过3组毒性表型参数组合（LC3B、Nuclear+Mn SOD+GSH+α-tubulin、Nuclear+MMP）完成测试,13参数组成的模型可通过3组毒性表型参数组合（LC3B+p H2AX、Nuclear+Mn SOD+GSH+α-tubulin、Nuclear+MMP）和3组应激通路（Nrf2、ATF6和Hif1a）检测完成。当该方法结合RO2时,IDILI药物显著升高至84%,但总体药物的特异性由94%降低至81%。2)基于全部受试药物的细胞毒依赖和非依赖的全部43个表型的最大效应值进行分层聚类,结合药物化学结构、靶标、适应症、损伤类型等信息进行分析,结果显示药物的细胞表型谱与化学结构、靶标及适应症密切相关,其中药物靶标的相关性最强,其次是化学结构和适应症。提示,在体内暴露浓度未知的情况下。通过表型谱的相似性的定位即可对未知化合物的DILI潜力进行预测评估。最后,本课题对细胞毒非依赖的细胞表型谱进行分层聚类,结合对应的细胞毒伴随的细胞表型谱分析,首次探讨了DILI药物肝细胞损伤机制的模式类型,结果显示F-actin＿24h和MMP＿24h降低或升高,LC3B＿16h、lyso＿16h和p H2AX＿16h增加,Hif1α＿3h、ATF6＿5h、Nrf2＿6h、NF-?B＿24h通路的激活可能是肝细胞损伤的早期独立事件,此外,还存在参数lyso＿16h与LC3B,lyso＿16h与MMP共同增加的早期事件和无明显早期细胞表型变化的类型;其中早期lyso＿16h增加、ATF6＿5h、Nrf2＿6h、Hif1α＿3h的分别激活往往伴随晚期多细胞表型的显著改变,早期MMP＿24h下降、Hif1α＿3h和NF-?B＿24h的激活与s DILI相关性强。结果提示药物诱发DILI可能存在一些共同的路径,早期毒性参数在药物毒性预测中具有重要的作用。综上,本课题采用HCA技术检测了223个受试药物对细胞全表型参数的影响,结合药物Cmax确定DILI特性,构建了受试药物的细胞表型谱数据库。在此基础上,首次通过机器学习、生物信息分析等技术及建模和验证、表型聚类分析等过程,创新性的建立了基于细胞表型模式分析的体外肝毒性预测体系。一方面,构建了含有7或13个表型参数结合药物Cmax预测的主体方法;另一方面,结合构建的药物表型谱数据库聚类分析进行肝毒性预测。最后,基于毒性不伴随和伴随的细胞表型谱的对比分析为全面认识DILI发生机制提供新的线索。