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研究背景：
转录因子BTB-CNC同源异构体1(Bach1)属于CNC转录因子家族,对血红素氧化酶1(HO-1)有特异的抑制作用,而HO-1是细胞中重要的保护酶。肿瘤细胞内HO-1表达可以影响肿瘤的生长,并且可影响肿瘤细胞对化学疗法的敏感性。在对肿瘤组织进行放疗,化疗等治疗后,HO-1表达会升高。鉴于HO-1在肿瘤治疗中对肿瘤细胞所起的保护作用,我们尝试通过提高Bach1的表达来达到抑制HO-1的表达的目的,然后通过药物敏感性试验检验当肿瘤细胞中HO-1表达降低时,肿瘤细胞对长春新碱(VCR)的敏感性是否有变化,会发生怎样的变化。
目的：
构建真核表达载体pBI-EGFP-Bach1,使其转染进肝癌细胞SMMC-7721后能降低其中HO-1的表达,通过MTT法检测转染重组质粒的肝癌细胞对长春新碱敏感性是否发生变化。
方法：
1、用PCR的方法从质粒pQE30-bach1扩增目的基因Bach1,用NheI和MluI分别双酶切质粒pBI-EGFP及PCR扩增的Bach1,用T4连接酶连接,构成重组质粒;
2、用RT-PCR鉴定Bach1基因插入成功后,将Tet-Off质粒和重组质粒pBI-EGFP-Bach1双转染人肝癌SMMC-7721细胞48h后,Bach1以及HO-1在细胞内的表达情况；
3、用MTT法检测转染重组质粒前后肝癌细胞SMMC-7721对长春新碱的药物敏感性是否有变化,得出各自的IC50；
4、RT-PCR检测转染组(VCR+Bach1)和未转染组(VCR)肝癌细胞SMMC-7721加入长春新碱后Bach1和HO-1的表达；
5、DNA Ladder检测转染组和未转染组肝癌细胞SMMC-7721在低浓度长春新碱作用下细胞凋亡条带；
6、细胞形态学观察转染组和未转染组SMMC-7721细胞在低浓度长春新碱作用下的变化。
结果：
1、用NheI和MluI双酶切以及PCR鉴定表明重组质粒pBI-EGFP-Bach1构建成功；
2、重组质粒转染入细胞内后提取细胞总RNA,经RT-PCR检测显示转染重组质粒pBI-EGFP-Bach1组Bach1的mRNA表达显著升高,同时HO-1的表达降低；
3、相同剂量药物作用下,转染了重组质粒pBI-EGFP-Bach1的细胞,凋亡率比未加入重组质粒的细胞明显升高。且在VCR浓度为0.15,0.25μg／ml的时候,p值小于0.05；在药物浓度为0.2μg／ml时p值小于0.01；未转染组的IC50为0.15μg／ml,转染组的IC50为0.21μg／ml。二者相比,转染组的半数抑制浓度低于未转染组28.6％；
4、加药后检测两组Bach1和HO-1的mRNA表达情况,转染组中Bach1表达增高,而未转染组的HO-1表达增高。且未转染组的HO-1的表达高于阴性对照组；
5、加入15μg／ml的VCR48h后提取各组DNA,电泳结果显示转染组出现凋亡条带,而此剂量下未转染组凋亡条带不明显；
6、加入15μg／ml的VCR后未转染组的SMMC-7721细胞形态上并未太大发生变化,但转染组可观察到大量细胞死亡,细胞体积变小变圆,细胞膜完整但有发泡情况。
结论：
1、本实验成功构建了转录因子Bach1的真核表达载体pBI-EGFP-Bach1,且证实转染该质粒后Bach1基因能够在人肝癌SMMC-7721细胞中表达,并能抑制HO-1的表达；
2、本实验通过MTT药敏试验,验证了重组质粒pBI-EGFP-Bach1能提高肝癌细胞SMMC-7721对长春新碱的药物敏感性,IC50由0.21μg／ml降低到0.15μg／ml,降低了28.6％；
3、经DNA Ladder验证可知,在低浓度药物作用下,转染了重组质粒的肝癌细胞SMMC-7721即可发生凋亡,而同等浓度下的SMMC-7721细胞并未产生明显的凋亡。细胞形态学观察亦可见。