营养直接影响机体的免疫状况,越来越多的研究证实日粮可以改变炎性细胞因子的释放,为一些病症的病因探讨提供了新方向。我国优质牧草资源缺乏,秸秆粗饲料配合高精料的日粮模式很普遍。课题组在前期研究发现,长期饲喂这种秸杆日粮的奶牛IFN-γ等细胞因子的分泌水平较高,可能会导致机体出现非感染性炎症状态,成为多种疾病的诱因,但是,IFN-γ对奶牛乳腺疾病的影响尚不清楚。为此,本研究在建立原代奶牛乳腺上皮细胞(Bovine mammary epithelial cells,BMECs)体外培养平台的基础上,开展了IFN-γ对细胞增殖、乳脂乳蛋白合成及对病原的易感性等方面的影响及其分子机制研究;并对奶牛乳腺进行活体采样,进行了体内验证。为饲料营养通过免疫调控乳腺泌乳及抗病力提供了新的基础。通过活检技术获得奶牛乳腺组织,应用免疫组化等技术检测显示秸秆饲料组(Corn straw,CS)较苜蓿组(Mixed forage,MF)IFN-γ及其受体(IFNGR1、IFNGR2)表达显著上调;自噬分子标志物LC3-II及P62表达显著变化,说明秸秆组自噬增强。为明确IFN-γ能否诱导BMECs自噬,运用Western blotting及透射电镜分析等实验方法分析IFN-γ诱导BMECs发生自噬。研究结果显示IFN-γ处理BMECs,其自噬标志蛋白LC3-II表达升高,LC3点状聚集物的形成以及自噬溶酶体等显微结构增多,自噬底物p62的降解增加。表明IFN-γ体内体外均可诱导BMECs自噬。为进一步探索IFN-γ诱导BMECs自噬的分子机制,本研究应用质谱、Western blotting等实验技术证实IFN-γ加速精氨酸耗竭,激活氨基酸感受器GCN2,增加e IF2a磷酸化调控自噬。相反,补充精氨酸可减少GCN2/e IF2a信号通路活化并抑制自噬。进一步通过RNA干扰GCN2明显抑制了IFN-γ诱导的BMECs中LC3-II的表达及p62的降解。表明IFN-γ加速精氨酸耗竭活化GCN2/e IF2α信号途径介导了BMECs细胞自噬。为确定自噬的发生对BMECs功能的影响,应用MTT、流式细胞术等方法检测显示激活自噬加速BMECs细胞周期进程,细胞生长加快,在软琼脂中形成细胞克隆能力增强表明BMECs发生恶性转化。进一步研究显示,上皮细胞-间充质细胞转化(EMT)并不参与这一过程,而自噬促进c-Abl入核增加HDAC2的稳定性,加强对细胞周期相关蛋白的调控,加速细胞周期进程。泌乳是BMECs最重要的功能,本研究发现IFN-γ通过活化自噬抑制乳脂乳蛋白的合成。通过自噬抑制剂干预自噬潮的形成,能够逆转IFN-γ抑制的乳脂乳蛋白合成,而自噬激动剂诱导自噬潮的形成,能够加剧IFN-γ抑制的乳脂乳蛋白合成。提示自噬介导了IFN-γ抑制的乳脂乳蛋白合成。补充精氨酸可减少GCN2/e IF2a信号通路活化并抑制自噬恢复乳脂肪乳蛋白合成。应用电镜观察等方法探讨了IFN-γ诱导的自噬在BMECs抵抗金黄色葡萄球菌感染中的作用。结果显示ITGA4参与了金黄色葡萄球菌粘附和侵入BMECs。透射电镜观察发现双层膜结构包裹菌体,平板计数显示抑制自噬,胞内菌明显增加,相反,增强自噬,胞内菌计数明显减少。表明自噬促进胞内菌清除。综上所述,IFN-γ在体内体外促进自噬。精氨酸耗竭活化GCN2/e IF2a信号途径介导了自噬的发生。自噬促进细胞恶性增殖、转化,抑制乳脂乳蛋白合成,有助于BMECs胞内金黄色葡萄球菌清除。本研究揭示了IFN-γ在BMECs诱导自噬及其分子机制,不仅为乳脂乳蛋白合成调控与乳腺免疫防御开辟了新的领域,也为防治乳腺相关疾病提供了新的思路与实验线索。