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莱茵衣藻是一种成熟的模式生物,其细胞核、线粒体、叶绿体三套基因组都可以进行遗传转化,具有培养条件简单、生长速度快、光合效率高等优点,基于细胞核转化体系可构建生产高附加值蛋白的“衣藻生物反应器”,具有广阔的应用前景。本课题首先构建莱茵衣藻细胞核转化体系,研究环形质粒的转化,成功表达人表皮生长因子(EGF)蛋白,再研究线性质粒的转化,解析单酶切条件及线性质粒共转化,为“衣藻生物反应器”提供了理论基础和试验指导。(1)通过研究衣藻核转化的关键因素,成功构建莱茵衣藻细胞核转化体系。衣藻培养条件:接种比为1%,培养温度20℃,光暗周期为16h/8h,光照强度为12000Lx,摇床转速120r/min,培养5天达到对数生长中期,呈深绿色。衣藻核转化条件:采用对数生长中期的衣藻,最佳质粒用量为3μg,最佳涡旋振荡时间为20s,TAP固体培养基中博来霉素抗性筛选浓度为15μg/mL,TAP液体培养基中博来霉素抗性筛选浓度为5μg/mL。经PCR、RT-PCR检测,证明ble基因已经成功整合进入衣藻细胞核基因组中,并在转录水平上表达。(2)基于衣藻核转化体系的构建,探究人表皮生长因子基因(EGF)的转化及表达。首先按照衣藻细胞核密码子偏好性改造并合成EGF基因,成功构建pSP108-EGF双元表达载体,采用玻璃珠法转化、博来霉素抗性筛选,经PCR、Southern blot、ELISA检测转化情况。结果表明:试验获得3株阳性衣藻,EGF和ble基因均已成功整合进入核基因组,其中EGF基因均以单拷贝形式存在并且整合在衣藻核基因组的不同位点,3株阳性衣藻中表达的EGF蛋白浓度分别为19.4 pg/mL、17.1 pg/mL、19.7pg/mL。(3)探究玻璃珠法转化线性质粒。进行pSP108质粒单酶切试验制备线性质粒,采用玻璃珠法转化,经博来霉素抗性筛选、PCR及RT-PCR检测转化情况,对转化条件进行优化。结果表明:经BamHⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ、SacⅠ单酶切制备的pSP108线性质粒均能成功转化,其中BamHⅠ单酶切的线性质粒转化率最高,ble基因成功整合进入莱茵衣藻核基因组,并且在转录水平表达。优化得到玻璃珠法转化线性质粒的条件:采用对数生长中期的衣藻,最佳质粒用量为4μg,最佳涡旋振荡时间为25s,最适博来霉素筛选浓度为15μg/mL。(4)研究线性质粒的共转化。首先按照衣藻细胞核的密码子偏好性改造并合成C反应蛋白基因(CRP),成功构建pCRP载体,采用BamHⅠ单酶切制备pCRP、pSP108线性质粒,玻璃珠法进行转化,通过15μg/mL博来霉素抗性筛选。提取衣藻转化子的DNA,经PCR检测,结果表明ble及CRP基因均已成功整合进入衣藻核基因组之中,经RT-PCR检测,结果表明仅ble基因在转录水平表达,CRP基因可能出现了“基因沉默”现象。