第一部分CK2抑制剂CX-4945逆转胃癌耐药细胞放射抗性的作用机制在我国,胃癌的发病与死亡处于恶性肿瘤第三位。据统计,2012年全国胃癌发病数约40万,死亡数约32万,胃癌病人五年生存率不足20%。手术、化疗、放疗是治疗胃癌的主要手段。早期胃癌可通过手术方式切除局部肿瘤病灶,晚期胃癌由于发生广泛浸润和转移,失去手术机会,则以放化疗联合治疗方案为主。肿瘤细胞对各种放化疗措施的耐受性往往导致放化疗失败。顺铂是胃癌化疗一线用药,主要通过诱导DNA交联—双链断裂损伤杀伤肿瘤细胞。肿瘤细胞可以通过发展多种耐药机制抵抗顺铂诱导的细胞凋亡,其中DNA损伤修复能力增强是最主要的机制。而放疗主要靶向DNA,通过诱导DNA双链断裂损伤抑制细胞增殖,引发细胞凋亡。对顺铂耐受的肿瘤细胞同时也会对放疗产生交叉耐受性。因此,研发针对放化疗交叉耐受关键分子的干预措施,对于有效逆转放化疗交叉耐受和提高胃癌治疗效果,具有十分重要的科学意义,也是目前临床肿瘤治疗急需解决的重大科学问题。酪蛋白激酶2(Casein Kinase 2,CK2),是一个多效的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。CK2在细胞生理活动的调节中处于中心地位,广泛参与细胞增殖、分化、死亡等过程,CK2表达及功能的异常往往导致肿瘤发生发展。CX-4945是近年来研发的特异性针对CK2的抑制剂,体内外研究发现CX-4945通过抑制CK2活性发挥抗肿瘤作用,可提高化疗效果,而CX-4945能否提高胃癌放疗效果,逆转胃癌细胞放疗抗性则未见报道。本实验室前期用浓度梯度法诱导建立了胃癌顺铂耐药细胞模型,发现DNA修复蛋白XRCC1表达异常升高介导顺铂所致DNA损伤修复过程是导致胃癌细胞产生顺铂耐受性的重要原因。进一步研究发现,顺铂耐药细胞中CK2表达升高是导致XRCC1高表达的重要机制,采用CX-4945能有效杀伤耐药细胞,提高其对顺铂敏感性。XRCC1是参与修复放射诱导的DNA损伤的重要分子,提示胃癌顺铂耐药细胞可能对放疗具有交叉耐受,而通过抑制CK2可逆转顺铂耐药细胞的放疗耐受。目的:研究胃癌顺铂耐药细胞放射抗性产生及逆转的分子基础。方法:在已经成功构建的胃癌顺铂耐药细胞株中采用细胞分子生物学技术比较耐药细胞与敏感细胞对辐射损伤修复能力的差异、XRCC1表达差异,探讨CK2、XRCC1等分子表达与胃癌顺铂耐药细胞放射抗性关系及其分子机制。结果:1.XRCC1介导胃癌顺铂耐药细胞放射抗性。在用浓度梯度法构建的两株耐药细胞BGC823/DDP、SGC7901/DDP及其敏感性亲本株中采用高能X-射线处理,结果显示DNA损伤程度显著低于相同剂量处理的敏感细胞。而胃癌顺铂耐药细胞中P-XRCC1水平显著高于敏感细胞。在敏感细胞中转染GFP-XRCC1表达质粒上调XRCC1表达可以显著抑制高能X-射线引起的DNA损伤;在耐药细胞中转染XRCC1 siRNA抑制XRCC1表达可以显著增加高能X-射线引起的DNA损伤。2.CK2抑制剂CX-4945通过抑制XRCC1增加X-射线诱导的DNA损伤。耐药细胞对CX-4945保持敏感性,CX-4945可抑制P-XRCC1水平,从而提高X-射线诱导的DNA损伤程度。3.CX-4945逆转顺铂耐药细胞对放射的抗性。克隆形成实验表明,顺铂耐药细胞对X-射线引发的细胞死亡具有显著的抵抗能力。而采用CX-4945可以提高X-射线诱导的顺铂耐药细胞死亡率。4.CX-4945逆转胃癌顺铂耐药细胞对于紫外UVB辐射的抗性。胃癌顺铂耐药细胞对于紫外UVB辐射引起的DNA损伤修复能力也显著增强,抵抗辐射诱导的细胞凋亡;当CK2抑制剂联合紫外UVB辐射后可以抑制XRCC1磷酸化使细胞不能修复紫外UVB诱导的DNA损伤,促进其损伤加重及凋亡。结论:本研究首次发现胃癌顺铂耐药细胞对放疗及紫外UVB辐射具有交叉耐受,阐明了 XRCC1在胃癌顺铂耐药细胞内修复放疗及紫外UVB引起DNA损伤的作用,首次提出通过抑制胃癌耐药细胞中CK2的表达,可以逆转其放射抗性。第二部分胃贲门癌组织CK2α的表达与放疗疗效的关系目的:采用免疫组化(immunohistochemistry,IHC)检测胃贲门癌单纯放疗患者胃镜活检组织中CK2和XRCC1的表达,探讨二者相关性以及和胃贲门癌放射治疗效果及与病人临床指标及预后生存的关系。明确以CK2为靶点,判断胃贲门癌患者放疗敏感度,作为个体化放疗的依据。方法:1.本研究所用资料来自中国人民解放军第八二医院肿瘤中心2010年1月至2013年12月收治的有手术禁忌或本人拒绝等原因未经手术治疗的首诊、无放疗禁忌症,年龄50岁以上、KPS评分大于70分并且病例资料完备的胃责门癌病人。46例患者都具备胃镜下活检病理诊断支持。患者中有36例男性,10例女性,年龄平均71.8±10.23岁,中位数71.2岁。分期选择我国目前普遍使用的非手术患者临床病理分期,Ⅰ期0例,Ⅱ期22例,Ⅲ期18例,Ⅳ期6例(其中肝转移4例,左锁骨上淋巴结转移2例)。2.应用免疫组织化学方法(SP法),检测46例胃贲门癌组织蜡块中CK2和XRCC1的表达情况,分析二者相关性以及和胃贲门癌放射治疗效果及与病人临床一般资料的关系。3.采用PASW Statistics 18统计软件包进行数据录入和分析,计数数据采用X2检验。采用X2检验分析CK2及XRCC1表达与临床资料参数间关系;采用单因素分析Kaplan-Meier法进行生存分析研究胃贲门癌患者预后影响因素。P<0.05差异有统计学意义。结果:1.贲门癌组织中CK2的表达水平与临床病理指标的关系贲门癌组织中CK2高表达定位于细胞浆,阳性表达率为45.7%(21/46)。卡方检验结果,CK2阳性表达和患者胃癌家族史、淋巴结转移、临床分期有关,存在统计学差异(P<0.05)。CK2在有胃癌家族史人群中阳性表达率为75.0%(9/12);有淋巴结转移组阳性率为56.3%(18/32)、无淋巴结转移组阳性率为21.4%(3/14);病例中无Ⅰ期患者,CK2阳性表达率Ⅱ期27.3%(6/22)、Ⅲ期66.7%(12/18)、ⅣV期50.0%(3/6)。CK2阳性表达和病人性别、年龄、KPS评分、慢性胃病史、主要症状表现、血红蛋白浓度、腺癌分化级别、远处转移没有关系,无统计学差异(P>0.05)。2.责门癌组织中XRCC1的表达水平与临床病理指标的关系责门癌组织中XRCC1高表达定位在细胞核,阳性表达率为65.2%(30/46)。卡方检验结果,XRCC1阳性表达和患者淋巴结转移、临床分期有关,存在统计学差异(P<0,05)。XRCC1在有淋巴结转移组阳性率为78.1%(25/32)、无淋巴结转移组阳性率为35.7%(5/14);病例中无Ⅰ期患者,XRCC1阳性表达率Ⅱ 期 45.5%(10/22)、Ⅲ 期 88.9%(16/18)、Ⅳ 期 66.7%(4/6)。XRCC1 阳性表达和病人性别、年龄、KPS评分、慢性胃病史、胃癌家族史、主要症状表现、血红蛋白浓度、腺癌分化级别、远处转移没有关系,无统计学差异(P>0.05)。3.贲门癌组织中CK2与XRCC1表达水平存在相关性CK2在46例胃癌患者中的表达21例,XRCC1在46例胃癌患者中的表达30例,卡方检验显示,两者表达有相关性(x2=4.267,P<0.05)。4.CK2和XRCC1的表达与胃癌放疗疗效的及预后的关系46例胃贲门癌患者中,CK2表达阳性者21例,放射治疗后复查影像学指标评价疗效5例CR,2例PR,有效缓解率RR(CR+PR)为33.3%(7/21);CK2表达阴性者25例,复查疗效评价12例CR,8例PR,有效缓解率RR(CR+PR)为80.0%(20/25),有统计学差异(P<0.05),说明CK2表达与放疗后近期疗效相关,CK2表达较低者放疗有效率较高(x2=10.252,P<0.05)。XRCC1表达阳性者30例,放射治疗后复查影像学指标评价疗效9例CR,4例PR,有效缓解率RR(CR+PR)为43.3%(13/30);XRCC1表达阴性者16例,复查疗效评价8例CR,6例PR,有效缓解率RR(CR+PR)为87.5%(14/16),有统计学差异(P<0.05),说明XRCC1表达与放疗后近期疗效也相关,XRCC1表达较低者放疗有效率较高(x2=8.396,P<0.05)。CK2高表达组和低表达组1、2年生存率分别为 33.3%(7/21)、14.3%(3/21)和 68.0%(17/25)、48.0%(12/25);XRCC1高表达组和低表达组1、2年生存率分别为40.0%(12/30)、23.3%(7/30)和 75.0%(12/16)、50.0%(8/16)。Kaplan-Meier 曲线生存分析结果,CK2 与XRCC1的表达水平和预后生存相关,二者表达阳性者生存期较短,表达阴性者生存期较长(P<0.05)。而且,CK2与XRCC1两个分子联合起来判断胃癌预后表现出比单个分子更大的预测效能。结论:1.CK2和XRCC1在胃贲门癌组织中表达均较高,并且有相关性;CK2与XRCC1的表达和淋巴结转移、临床病理分期相关,提示期别越晚,二者阳性越高。可能与胃癌家族史有关。与患者性别、年龄、KPS评分、慢性胃病史、临床主要症状(上腹痛、吞咽困难、消瘦)、血红蛋白浓度、分化级别、远处转移没有关系。2.CK2及XRCC1高表达患者放疗有效率显著低于低表达患者,CK2和XRCC1高表达者1年、2年生存率显著低于低表达者。本研究通过CK2蛋白在体内表达程度的差异和临床放疗及预后的关系,说明CK2作为胃癌患者个体化放疗分子标志物的潜在价值以及CK2作为胃癌放化疗交叉耐受逆转治疗的新靶点,为CK2抑制剂CX-4945应用于胃癌临床放疗增敏提供了理论依据。