龋病是一种多因素引起的细菌感染性疾病，变形链球菌是其主要致病菌。葡聚糖结合蛋白是变形链球菌的主要致龋毒力因子之一，在细菌的黏附和聚集，促进菌斑的形成中起着重要作用。免疫防龋是目前龋病预防研究的热点之一。基因疫苗是上世纪90年代发展起来的一种诱导免疫治疗的新方法，与减毒活疫苗、灭活疫苗、重组亚单位疫苗等疫苗相比，它具有长期稳定表达抗原蛋白，在宿主体内表达的蛋白与天然构象更为接近，抗原性更强等优点。目前，基因疫苗免疫防龋仅限于对变形链球菌表面蛋白、葡糖基转移酶、葡聚糖结合蛋白A的研究，关于利用葡聚糖结合蛋白B构建防龋基因疫苗的研究国内外还未见报道。已有的研究证实，葡聚糖结合蛋白B具有良好的免疫原性，但能否作为免疫防龋的候选基因疫苗，正是本研究所要解决的问题。 本研究从变形链球菌S. mutans Ingbritt基因组DNA中克隆出gbpB的全长编码区基因片段，进行原核表达，获取大量纯化蛋白，同时制备抗GbpB的特异性抗体；构建GbpB的真核表达质粒作为基因疫苗，通过不同途径免疫动物，观察基因疫苗的免疫效果；通过建立定菌鼠实验模型，观察了重组纯化蛋白和基因疫苗的抑龋效果，充分说明了GbpB可作为免疫防龋的候选基因疫苗，为其在免疫防龋中的进一步研究及应用打下了实验基础。 第四军医大学博士学位论文 本研究共分为三个部分：第一部分：变形链球菌gbpB的克隆和序列分析 常规厌氧培养 S．mutans Ihgbritt，提取细菌基因组DNA作为模板；根据Genbank报道序列设计一对引物，采用 PCR方法扩增 gbpB的全长编码区基因片段：将获取的基因片段定向插入克隆载体 pBlll既Cript KS中，转化感受态细胞且。。h DHS a，挑取阳性克隆，鉴定后测序。测序结果经BLAST分析与文献报道基本一致。第h部分：变形链球菌gbPB在原核和真核细胞中的表达 将测序正确的gbPB定向插入原核表达载体pPROEXTMHTb，构建原核融合表达质粒 pPROEX”“HTh－gbpB，转化感受态细胞 Ecoli DHS a BLZI，IPTG诱导表达融合蛋白GbpB，SDS－PAGE检测表达产物，结果在SDS－PAGE凝胶上出现一条新生蛋白条带，其相对分子量约为50KD，与预计大小相符。 通过金属螫合亲和层析（NJ＋－NTA介质）纯化，大量获取了 GbpB融合蛋白；并用纯化的融合蛋白常规免疫家兔制备抗血清，ELISA鉴定，结果表明成功获得 GbpB的特异性抗血清，抗体滴度为 1历4，效价为卜 10，000。 将测序正确的＋b＋B定向插入真核表达载体pcDNA3．l什），构建真核表达质粒pcDNA3．l什＞gbpB，将其瞬时转染至哺乳动物细胞COS7中，并设对照组和空白组。结果发现pCDNA3．1什卜gbpB在COS7细胞的胞浆中呈阳性表达，胞核中未见表达，而对照组和空白组中胞浆和胞核均呈阴性表达。说明所构建的真核表达质粒转染哺乳动物细胞后能够在细胞内翻译、表达，表达的蛋白质位于胞浆中，可与抗GbPB抗体特异性结合，具有抗原性，可作为基因疫苗。第H部分DNA防龋疫苗免疫动物及抑龋实验研究 大量制备重组质粒 pCDNA3．l什）－gbpB，分鼻腔滴注组、颌下腺区皮下注射组兔疫SD大鼠，并设对照组和空白组，采用ELISA法检测血清及唾液中D叩ao用闪一tofons——th）－ D—t1St’’～ 厂肘村U ．4－ 第四军医大学博士学位论文一抗体水平的变化情况。结果发现实验组血清IgG特异性抗体和唾液IgA抗体明显升高，且鼻腔滴注组和颌下腺区皮下注射组的血清IgG抗体水平无显著差异O＞0．05厂 颌下腺区皮下注射组产生的唾液IgA显著高干鼻腔滴注组O刎．of人说明基因疫茵通过腺周皮下注射免疫途径最能有效激发特异性抗体产生，是一种较为理想的防龋基因疫苗的免疫接种途径。 建立定菌鼠致龋实验模型，用纯化的 GbpB蛋白和 pcDNA3．l什XgbpB基因疫苗通过颌下腺区皮下注射途径免疫定菌鼠，采用ksyeS龋齿计分法评价龋损程度。结果发现实验组龋损范围和龋坏程度均明显低于对照组…刃．of厂但纯化的GbpB蛋白组和基因疫苗组间并无显著性差异O川．05人说明基因疫苗和纯化重组蛋白一样，均具有明显的免疫防龋效果。