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近年来,随着肥胖人群的与日俱增,肥胖对人体健康潜在的危害性越来越受到人们的关注。胰岛素抵抗是肥胖关键特征,由脂肪组织脂质过量堆积引起的能量代谢及器官调节紊乱所导致。大量的临床和流行病学证据表明,肥胖与多种心血管疾病有关,可直接或间接地增加心血管疾病的发病率和死亡率。然而目前肥胖诱导心肌损伤的机制尚未明确,胰岛素抵抗可能通过诱发葡萄糖代谢和脂质代谢紊乱等引发心肌损伤。目前,胰岛素抵抗诱导的心肌损伤的防治策略以控制体重和血糖为主,缺少合适的干预药物。因此,合理应用转录组学等生命组学方法,有望揭示胰岛素抵抗诱导的心肌损伤的发病机制,靶向发病机制开发防治药物。短链脂肪酸盐丁酸钠(NaBu)具有抑制组蛋白去乙酰化酶的作用,在改善体重、糖代谢等方面也具有积极作用。研究发现,在高脂饮食诱导肥胖动物模型中,NaBu干预可显著降低体重,改善胰岛素敏感性,提高葡萄糖耐量,改善胰岛素信号传导。提示,丁酸钠可以有效降低肥胖患者并发症发生率,减少其死亡率。胰岛素抵抗导致胰岛素作用受损,胰岛素是维持功能机体代谢稳态的重要激素,可通过PI3K-Akt通路使6磷酸果糖2激酶/果糖2,6二磷酸酶1(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 1,pPFKFB1)去磷酸化并激活其激酶活性,从而促进糖酵解途径。胰岛素抵抗模型中,具体如何影响糖酵解途径尚未完全明确。Nur77是孤儿核受体超家族中的一员,它的表达受到组蛋白去乙酰化酶调控。文献报道,Nur77是骨骼肌中葡萄糖代谢的新型调节剂,而且Nur77可以通过与细胞质中的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(phosphoenolpyruvate carboxykinase1,PEPCK1)相互作用,并使其稳定来激活肝癌细胞中的糖异生,从而干预糖酵解过程。最新的研究报道指出,Nur77可以直接与WFDC21P启动子上的两个NBRE结合以激活其转录,抑制糖酵解过程。但是,在高脂饮食诱导心肌损伤中,Nur77是否参与心肌细胞中糖酵解的调控,仍有待进一步确证。综上所述,肥胖诱导的胰岛素抵抗是心血管疾病的独立危险因素,但尚缺乏充分的机制研究,应用转录组学方法深入阐释胰岛素诱导心肌损伤的发病机制,有助于开发肥胖相关心肌并发症的防治药物。同时,NaBu可有效调控机体血糖平衡和心肌能量代谢稳态,可能干预肥胖诱导的胰岛素抵抗过程。研究目的:本研究拟采用转录组测序技术筛选胰岛素抵抗模型小鼠心肌差异表达基因,及核心富集通路。通过体内外实验验证关键基因,探讨关键差异基因Nur77通过HK2调控胰岛素抵抗心肌细胞糖酵解代谢紊乱机制;同时基于体外心肌细胞胰岛素抵抗模型,观察丁酸钠对胰岛素抵抗诱导的心肌损伤的保护作用,以及基于Nur77通路对心肌糖酵解途径的影响。实验方法:采用C57BL/6J雄性小鼠,高脂饲料喂养8w,建立胰岛素抵抗模型。8w后测量小鼠体重,取材;采用ELISA方法检测小鼠血清中TC和TG含量;采用OGTT实验分检测小鼠葡萄糖耐量;采用试剂盒检测血清心肌酶含量及炎症因子IL-6和TNF-α水平;采用HE染色检测小鼠心肌细胞形态;采用转录组测序方法,筛选胰岛素抵抗模型心脏中差异基因及核心富集通路;采用Western blot,qPCR的方法,检测小鼠心肌潜在差异基因及蛋白表达,验证转录组学结果。采用棕榈酸(PA)诱导H9c2细胞胰岛素抵抗模型,采用MTT方法,筛选棕榈酸作用浓度;采用qPCR验证转录组DEGs关键基因表达;采用Western blot方法检测Nur77和HK2的表达;给予细胞Nur77激动剂、Nur77 siRNA,采用Western blot和qPCR方法检测Nur77和HK2的表达。采用MTT方法,确定丁酸钠作用浓度;采用Western blot方法检测细胞内Casepase-3、Bcl-2、Nur77、HK2、p-ERK、pCREB表达;采用qPCR检测细胞Nur7和HK2表达;给予细胞Nur77激动剂和丁酸钠,采用Western blot和qPCR方法检测Nur77和HK2的表达;干扰细胞内Nur77同时给予丁酸钠,采用Western blot方法检测Nur77和HK2的表达。实验结果:(1)高脂饲料喂养小鼠8w建立胰岛素抵抗模型。喂养后小鼠体重显著增加。生化结果显示,血脂显著升高,提示模型建立成功。血清心肌酶和炎症因子水平升高,同时HE染色结果提示心肌损伤,可用于进一步转录组分析。转录组筛选出184个差异基因,明确糖酵解途径是关键差异通路,Nur77、Lpar-2、pck1、gck、lamb3、fgf21、alox15和ccna1为筛选出的主要差异基因。qRT-PCR验证差异基因表达,结果显示主要差异基因在心肌中出现显著的表达改变,且在糖酵解途径中,HK2作为糖酵解途径的第一个关键酶差异表达显著降低。(2)基于棕榈酸诱导的H9c2胰岛素抵抗模型,qPCR检测差异基因表达,发现Nur77、Lpar-2、pck1、gck、lamb3、fgf21、alox15和ccna1等基因表达趋势与体内一致。同时发现,棕榈酸能够上调Nur77的表达、下调糖酵解途径关键酶HK2的表达。通过Nur77激动剂处理和Nur77 siRNA干扰,证明棕榈酸是通过上调Nur77的表达,发挥干预糖酵解途径的作用。(3)基于MTT结果显示,丁酸钠的最佳给药浓度为1mM;给予H9c2丁酸钠和棕榈酸,Western blot和qPCR结果显示,丁酸钠能改善棕榈酸引起的Casepase-3、Nur77、p-ERK、p-CREB蛋白的高表达;降低棕榈酸所致的Bcl-2、HK2的低表达。同时给予丁酸钠、棕榈酸和Nur77激动剂和同时给予丁酸钠、棕榈酸和Nur77 siRNA,Western blot和qPCR结果显示,丁酸钠能够通过降低Nur77的表达改善棕榈酸造成的HK2的低表达,从而发挥对心肌细胞的保护作用。实验结论:(1)在小鼠胰岛素抵抗模型心肌组织中,糖酵解途径是核心富集通路,Nur77为关键差异表达基因。(2)棕榈酸诱导的H9c2胰岛素抵抗模型中,Nur77通过抑制糖酵解途径关键酶HK2的表达,介导心肌细胞糖酵解途径的抑制。(3)H9c2胰岛素抵抗模型中,丁酸钠通过抑制Nur77的表达,上调糖酵解关键酶HK2的表达,提高细胞存活率,减少细胞凋亡。