肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,是全球癌症患者死亡的重要原因。尽管随着医疗水平的不断进步,近年来肺癌的治疗手段得到了不少的提高,但是肿瘤的发生与发展受到许多复杂因素的共同作用,患者的五年生存率仍然很低。因此,迫切需要发现与研究对于肺癌的早期检测、诊断、预后和监控有意义的新颖而有效的生物标记物(癌基因/抑癌基因),并阐明其作用机制。Wnt信号通路在正常胚胎发育以及多种癌症发生发展过程中发挥着重要作用。在Wnt信号通路中,Wnt配体与脂蛋白受体相关蛋白5/6(lipoprotein receptor-related protein5/6,LRP5/6)和跨膜受体Frizzled相结合,导致β-catenin在细胞浆的含量增高。增多的β-catenin从细胞浆移至细胞核内,并与TCF/LEF形成复合体,从而介导其靶基因的转录。经典Wnt通路的活化在肿瘤发生发展的过程中是一个致癌途径。OSR1(odd-skipped related 1)属于OSR家族基因,是一种编码胚胎发育所需的含有3个C2H2锌指结构域的转录因子。作为最早发现的中胚层的标记物之一,目前关于OSR1的研究还多处于胚胎发育的领域,例如胚胎心脏和泌尿生殖系统的发生以及舌和肾脏的发育过程。在此进程中,OSR1可以与多种因子相互作用,并在严格的机制调控下引导胚胎的形态发育。而近期有报道指出,OSR1在胃癌和肾细胞癌中发挥着抑癌基因的作用,并且与胃癌的不良预后有关,可以在临床肿瘤的早期筛查过程中作为一个新的生化指标。目的:检测OSR1在肺癌组织中的表达情况及其与临床病理因素之间的关系,探讨OSR1在肺癌增殖和侵袭转移中的作用及其参与的信号通路分子机制。研究方法:收集2012年到2015年在中国医科大学附属第一医院行手术切除的250例肺癌组织,以及126例对应的癌旁正常肺组织(距离癌组织大于5cm)石蜡包埋标本。另外收集2016年行手术切除的30对肺癌组织和相应的正常组织新鲜标本,切除后立即放入-80°C冰箱保存。使用免疫组织化学方法检测OSR1在肺癌中的表达情况,并分析其与多种临床病理因素之间的关系;使用Western blot方法检测肺癌组织以及多种肺癌细胞系中OSR1的表达情况;分别在H1299细胞系中转染OSR1质粒来提高它的表达量,在A549细胞系中转染OSR1的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)降低其表达量,通过细胞增殖实验、克隆形成实验和基质胶侵袭实验探讨OSR1对肺癌细胞增殖与侵袭的影响;通过过表达和抑制β-catenin的表达验证OSR1对肺癌细胞增殖和侵袭的影响是否通过抑制β-catenin的活性;通过Western blot方法检测肺癌细胞中过表达或敲除OSR1对Wnt信号通路蛋白及其下游靶基因表达水平的影响。通过共转染及共干扰OSR1及SOX9基因,并使用real time PCR及Western blot方法检测OSR1,SOX9,GSK3β及β-catenin的表达情况来进一步探讨OSR1在肺癌中发挥作用的可能机制。结果:1、OSR1在癌旁正常肺组织中高表达,而在肺癌组织中呈现低表达。OSR1在肺癌组织中的低表达与肺癌患者的分化程度相关(P值)。30对新鲜肺癌组织中OSR1的蛋白表达水平明显低于其配对的癌旁正常组织(P值)。在新鲜肺癌组织中OSR1和β-catenin的蛋白表达水平成负相关(P值,相关系数)。OSR1在4种肺癌细胞系的表达均低于它在正常支气管上皮细胞(HBE)的表达。2、在H1299细胞中转染OSR1质粒,可以抑制肺癌细胞的侵袭能力、集落形成能力以及增殖能力;而在A549细胞系中转染OSR1-siRNA,则增强了肺癌细胞的侵袭能力、集落形成能力以及增殖能力。3、在H1299细胞中转染OSR1质粒可以明显提高GSK3β的表达,降低p-GSK3β,activeβ-catenin,核β-catenin和Wnt通路靶基因cyclin D1,c-Myc以及MMP7的表达,而axin,DVL1,LRP6和LEF1的表达无明显变化。在A549细胞中转染OSR1-siRNA后则可以降低GSK3β的表达,增加p-GSK3β,activeβ-catenin,核β-catenin和Wnt通路靶基因cyclin D1,c-Myc以及MMP7的表达,而axin,DVL1,LRP6和LEF1的表达无明显变化。4、为了检测OSR1对肺癌细胞增殖及侵袭的抑制作用是否通过抑制β-catenin的活性,我们在H1299和A549细胞中单独改变OSR1的表达水平,或者同时改变OSR1和β-catenin(CTNNB1)的表达水平。我们发现在H1299细胞中过表达OSR1可以明显抑制肺癌细胞的侵袭能力,集落形成能力和增殖能力。但是,当共转染OSR1和β-catenin(CTNNB1)时,这些抑制作用被逆转。另一方面,在A549细胞中抑制OSR1的表达,可以增强肺癌细胞的侵袭能力,集落形成能力和增殖能力。而当OSR1和β-catenin(CTNNB1)的表达共同被抑制时,这些促进作用减弱,即β-catenin的过表达可以逆转OSR1对肺癌细胞的抑制作用。5、当在H1299细胞中转染SOX9后,β-catenin的mRNA水平升高;而在A549细胞中转染SOX9-siRNA后,β-catenin的mRNA水平降低。在转染了SOX9质粒的H1299细胞中,GSK3β的蛋白水平下降,β-catenin的蛋白水平升高;而转染了SOX9-siRNA的A549细胞中,GSK3β的蛋白水平升高,β-catenin的蛋白水平降低。同时,在转染了OSR1质粒的H1299细胞中,SOX9的mRNA和蛋白水平下降;而在A549细胞系中转染OSR1-siRNA后,SOX9的mRNA和蛋白水平均升高。OSR1的过表达可以减弱SOX9对β-catenin的促进作用,对GSK3β的抑制作用。也就是说,OSR1可以通过抑制SOX9在肺癌中的转录和表达,从而间接下调β-catenin的表达。结论:1、OSR1在肺癌组织中低表达并与分化程度相关;2、OSR1可以抑制肺癌细胞的增殖和侵袭能力;3、OSR1通过下调SOX9的转录和上调GSK3β表达来抑制β-catenin的表达和Wnt信号通路活性。