解脲脲原体诱导脐静脉内皮细胞凋亡及其机制的研究

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近年来,解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,UU)在产科领域的感染引起医学界的不断关注。据报道,在自然流产、胎膜早破及早产等产妇胎盘中检出 UU的阳性率显著高于正常产妇,亦有人从自然流产者的死胎和畸胎中培养出 UU,提示妊娠期间生殖道UU感染可经胎盘垂直传播,导致妊娠过程恶化,从而引发不良妊娠结局。脐静脉是妊娠期间胎儿从母体获取营养供应的通道,脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)衬覆于血管内壁,是构成血管通透性的主要屏障,在免疫防御方面发挥重要作用。大量研究证实,半胱天冬酶(caspase)是引发细胞凋亡的基本结构及凋亡的执行器,可以通过线粒体/细胞色素 c通路和死亡受体通路两种不同的信号传导途径诱导细胞凋亡,本实验拟通过将UU与 HUVEC在体外共培养,通过细胞凋亡相关因素的检测,来探讨UU诱导HUVEC发生凋亡的分子生物学机制,从而为阐明妊娠期间UU垂直传播的可能机制提供实验依据。  用血清4型UU标准菌液作用于处于对数生长期的人脐静脉内皮细胞,建立感染模型;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;比色法检测 caspase3、caspase8和caspase9产生量;酶标仪检测 TNFα产生量;分别加入 TNFα抗体、caspase3、caspase8和caspase9抑制剂与HUVEC孵育后加UU,流式细胞术检测细胞凋亡率有无改变。  用100μl浓度为106CCU/ml的血清4型UU标准菌液刺激处于对数生长期的HUVEC,同时设立正常对照组(UU液体培养基刺激),分别在体外培养2,4,8,12小时后终止刺激,取细胞做ANNEXIN V FITC/PI染色,流式仪检测凋亡率,显示实验组 HUVEC凋亡率明显高于对照组(P<0.01),且随着诱导时间的延长,空白对照组、实验组凋亡率均随之升高(P<0.01),说明UU可以在体外诱导HUVEC凋亡。  采用同样方法感染HUVEC,同时设立正常对照组,于作用8小时后终止培养,取细胞培养液上清,比色法检测caspase3、caspase8和caspase9产生量,结果显示:与对照组相比,UU作用组 caspase3、caspase8和caspase9的产生量均明显升高(P<0.01)。酶标仪检测TNFα产生量,结果显示:UU作用组TNFα的浓度较对照组明显升高(P<0.01)。  加入TNFα抗体、caspase3、caspase8和caspase9抑制剂8小时后流式细胞术检测 HUVEC凋亡率,结果显示:加入抑制剂组的细胞凋亡率明显低于UU作用组(P<0.05)。提示caspase3、caspase8、caspase9和TNFα在HUVEC的凋亡中发挥一定作用。实验说明解脲脲原体可以诱导人脐静脉内皮细胞异常凋亡,其作用机制可能是通过 TNFα介导的caspase8及 caspase3激活的死亡受体通路以及由caspase9和caspase3参与的线粒体/细胞色素c通路。
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