研究背景随着人口老龄化及城镇化进程的加速,我国心血管疾病(Cardiovascular diseases,CVD)患病率及死亡率仍处于上升阶段。目前,CVD死亡占城乡居民总死亡原因的首位,在农村为44.8%,城市为41.9%,已经严重威胁人类健康[1]。预测截止2030年,我国CVD患者将增加2130万,因此疾病而死亡的患者将增加770万[2]。因此,CVD已逐渐成为人们所面临的重要健康问题,了解各种CVD疾病的发病机制并针对相应靶点进行对应预防和治疗已刻不容缓。心力衰竭是目前CVD中最常见,对患者危害最大的疾病,许多CVD患者最终死于该疾病。随着对该疾病研究的不断深入,越来越多证据表明心力衰竭发生和发展的基础是心肌肥大[3]。因此对心肌肥大过程中心肌细胞接受相应刺激后下游一系列胞内的确切机制的研究越来越引发人们的关注。尾加压素II(Urotensin II,UII)是一种生长抑素样环肽,最早是在硬骨鱼的脊髓尾部神经分泌系统被发现并分离出来,人体内UII(h UII)也于1998年被克隆出来[4]。UII及其受体分布十分广泛,人体内多种组织中都可发现其表达,尤以心血管系统内分布最多。UII是目前发现的最强的缩血管物质,但其作用并不仅限于此,在不同种属、身体不同部位对血管的作用也千差万别。还有研究表明,UII也可调节心功能。有实验表明,在离体实验中,UII对人的心房和心室表现出正性肌力作用,其对于右心房肌小梁收缩的促进作用呈剂量依赖性[5]。Douglas等提出,与早期充血性心力衰竭患者相比,h UII及其受体的m RNA在慢性心力衰竭终末期患者心肌细胞中表达明显增加[6]。Lapp等发现人体内血浆h UII明显升高与心功能损害正相关[7]。我们前期研究也发现UII呈浓度依赖性的抑制大鼠心功能。因此,对UII诱导心肌肥大通路机制的研究可为预防治疗该疾病提供新的思路。另有研究提示,心肌细胞的肥大过程涉及多条信号通路,比如G蛋白、小G蛋白、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、蛋白激酶C、TGF-β等,但UII对于诱导心肌肥大是否同样依赖于这些通路尚未可知。本实验前期研究结果表明,PKA信号通路在UII诱导的心力衰竭大鼠中发挥至关重要的作用。在Langendorff离体大鼠心脏模型上,PKA的特异性抑制剂KT-5720可以阻断UII作用于心力衰竭大鼠心脏功能的作用,由此可推断出UII可能通过PKA途径对大鼠心脏功能进行调节。那么,UII在致心肌肥大过程中,PKA信号通路是否参与了这一过程,如若参与,可能涉及的细胞分子机制是什么?近期有文献报道,UII致心肌肥大效应与心肌细胞内Ca2+及其相关通路活化有关,心肌细胞的肌浆网可通过调节多种钙调蛋白保持Ca2+进出胞浆处于动态平衡状态,从而使其浓度保持在一定范围内,进而调控心肌细胞的收缩和舒张功能。本实验前期研究结果也表明UII可能通过PKA途径抑制心室肌细胞L-型钙电流而发挥心功能抑制作用,故本课题推测UII致心肌细胞肥大作用可能与PKA信号通路及下游钙相关调控蛋白对胞内Ca2+浓度的调节有关。本实验计划分三个部分进行。首先,在腹主动脉缩窄术所导致的心衰模型上,观察模型大鼠心功能情况及心肌细胞形态学变化,检测胞内UII及钙相关蛋白的表达情况。其次,在离体培养的乳鼠心肌细胞上,给予不同浓度UII处理,在不同时间点进行相应的分析检测,观察胞内UII、Ca2+及相关蛋白的表达变化是否受到UII浓度和处理时间的影响。最后,在离体培养的乳鼠心肌细胞中加入PKA的特异性抑制剂KT-5720,观察PKA信号通路被阻断后UII对心肌细胞肥大作用的诱导是否会改善。本实验拟探明UII对心肌肥大诱导作用的机制是否与PKA信号通路及下游各种钙调蛋白相关,为今后心肌肥大乃至心力衰竭疾病的预防和治疗的过程提供新的干预靶点。第一部分UⅡ在慢性压力超负荷大鼠心肌组织中表达的变化目的:观察慢性压力超负荷大鼠的心功能情况,心肌组织形态学以及UII、PKA及相关蛋白表达情况。方法:采用腹主动脉缩窄术建立慢性压力超负荷大鼠模型,随机选取32只为假手术组,其余40只制作腹主动脉缩窄模型,于造模后2w、4w、8w、12w动态观测各项指标:⑴超声心动图对心功能进行整体评价;⑵右颈总动脉插管行血流动力学检测;⑶HE染色观察心肌组织形态变化,进而推断病理改变;⑷免疫组化学法观察UⅡ、RYR2、PKA、p-PKA、ser16p-PLN、PLN、SERCA2a在心肌组织中表达的变化。结果:(1)超声心动图结果显示模型组动物室间隔厚度(IVST)、左室后壁厚度(LVPWTd)左室舒张末期内径(LVDd)于术后均明显增厚,至术后12w时,厚度增加极显著,心室腔扩大。(2)血流动力学结果显示,随着造模时间的增加,造模后左心室舒张末压(LVEDP)增加,左心室收缩压(LVSP)、左心室压力上升/下降最大速率(+dp/dtmax、-dp/dtmax)逐渐降低,造模8w后差异极其显著。(3)HE染色结果显示模型组动物心肌细胞肥大,心肌纤维增生,心肌细胞排列紊乱,尤以8w、12w显示最为明显。(4)免疫组化结果显示模型组UII、Ry R2、p-PKA、p-PLN、SERCA2a等蛋白的表达量显著增加并表现出时间依赖性。结论:(1)通过腹主动脉缩窄术建立慢性压力超负荷心力衰竭大鼠模型,结果发现心室腔增大,心肌出现肥大,心肌纤维化增生,且呈时间依赖性。(2)UⅡ、RYR2、p-PKA、ser16p-PLN、SERCA2a在心肌组织中的表达呈时间依赖性增加。(3)PKA信号通路可能在UII促进心力衰竭发生过程中发挥重要作用。第二部分UrotensinⅡ在诱导心肌细胞肥大过程中的作用目的:进一步探讨不同浓度UII在不同作用时间下对离体培养乳鼠心肌细胞的作用。方法:对乳鼠心肌细胞进行分离和培养,将原代心肌细胞随机分组:⑴正常对照组;(2)UⅡ组(U II浓度分别是10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L),每种浓度的UII分别在不同的作用时间点进行检测(12h、24h、48h)。采用MTT法检测心肌细胞的活力情况,应用倒置相差显微镜下观察心肌细胞生长状态,采用图像分析软件测量心肌细胞的截面面积,BCA法检测心肌细胞胞内蛋白质总量,Hoechst33258染色检测心肌细胞胞内DNA的总量以及相应蛋白质/DNA的比值,Fura-3AM荧光染色用于检测心肌细胞胞浆内钙离子浓度变化,Western blot方法检测离体培养心肌细胞胞内ANP、p-PKA、PKA、Ry R2、p-PLN、PLN、SERCA2a蛋白的表达变化。结果:(1)MTT实验结果显示,在相同处理时间下,从无UII到10-6mol/L浓度下,活的心肌细胞数量有随UII浓度增加而呈显著增加的趋势。UII处理时间延长,细胞活性也随时间依赖性增强。(2)离体培养的乳鼠心肌细胞截面面积、蛋白质总量有显著增加的趋势(p<0.05),而DNA总量无显著变化,相应蛋白质/DNA的比值也显著升高(p<0.05)。(3)随着UII处理浓度的增加(从0-10-6mol/L),心肌细胞胞内Ca2+浓度呈显著上升趋势。(4)与对照组相比,UII处理组的心肌细胞中ANP、p-PKA、Ry R2、p-PLN、SERCA2a等蛋白的表达量均呈剂量依赖性的升高,且在10-9mol/L的处理浓度下即表现出与对照组显著的差异(p<0.05)。结论:(1)UII可增强心肌细胞的活性,并可诱导心肌细胞肥大。(2)UII诱导心肌细胞肥大作用可能有PKA信号通路的参与。第三部分PKA信号转导通路在UⅡ促进心肌细胞肥大过程中的作用及其机制研究目的:探讨PKA信号通路参与UII诱导的心肌细胞肥大作用及其机制。方法:乳鼠心肌细胞分离和培养,采用原代心肌细胞随机分组:⑴对照组;⑵UⅡ组:UⅡ10-8mol/L;⑶UⅡ+KT-5720组:UⅡ10-8mol/L+KT-5720;(4)KT-5720组。于倒置荧光显微镜下拍照,并用相应软件测量心肌细胞的截面面积,检测心肌细胞胞内蛋白质总量(BCA法),Hoechst33258染色检测心肌细胞胞内DNA的总量,计算相应蛋白质/DNA的比值,Fura-3AM荧光染色用于探测心肌细胞胞浆内钙离子浓度变化,Western blot方法检测离体培养心肌细胞p-PKA、PKA、p-PLN、PLN、SERCA2a的蛋白表达变化。结果:(1)10-8mol/L浓度的UⅡ处理可诱导心肌肥大,而KT-5720预处理则可抑制心肌细胞的肥大。(2)UII可导致肥大心肌细胞内钙离子浓度升高,KT-5720预处理可减弱钙浓度的升高。(3)KT-5720的预处理可使UII诱导的p-PKA、p-PLN、SERCA2a等蛋白的升高显著降低。结论:PKA信号通路参与了UII诱导的心肌细胞肥大过程。