核心结合因子(core-binding factor α1，cbfal)是近几年发现的与骨发育密切相关的转录因子，在成骨细胞分化和骨形成过程中发挥重要作用。cbfal是调控成骨细胞特异性基因表达的主控基因，该基因只在与成骨相关的细胞中表达，如果在非成骨细胞中强制表达，则该细胞出现成骨细胞的特征。在基因敲除实验中，cbfal缺陷纯合鼠无骨的形成，杂合鼠则出现成骨细胞功能下降，包括成骨细胞数量减少、组织中骨基质蛋白缺乏以及碱性磷酸酶活性降低等。所有研究均表明cbfal在骨形成中具有重要地位。 目前对cbfal的研究多集中于骨发育及成骨细胞分化方面，关于cbfal与机械力介导的正畸成骨的相关性研究尚未见报道。正畸牙槽骨改建包括破骨和成骨两个过程，是正畸牙齿移动中的主要生物学过程。牙周膜细胞是正畸力的效应细胞，可能同时参与了正畸牙槽骨改建的成骨和破骨过程，并发挥重要作用。因此，研究牙周膜细胞在机械应力作用下cbfal的表达，对于 第四军医大学博士学位论文3 探讨牙周膜细胞和Cbfal在正畸成骨中的作用机制以及正畸牙齿移动的机理 都是有意义的。因cbfal的检测试剂尚未商品化，所以本研究从基因克隆入 手，自制了Cbfal的抗体和探针，采用免疫组化和原位杂交的方法，检测了 人牙周膜细胞在弹性牵张力作用下Cbfal的表达，初步探讨Cbfal在正畸成骨 中的作用机制。研究内容如下： 一、大鼠颅骨成骨细胞的原代培养和鉴定 目的：体外原代培养大鼠颅骨成骨细胞，为下一步的基因克隆实验提供 细胞来源。方法：采用组织块法体外原代培养新生SD大鼠颅骨成骨细胞， 并利用差数贴壁法进行纯化。用碱性磷酸酶活性检测和钙化结节 VOn Kossa 染色进厅鉴定。结果：原代培养的成骨细胞呈立方形、多角形或短梭形，细 胞融合后呈“菊花状”复层重叠生长，细胞能在体外形成钙化结节。钙钻法 碱性磷酸酶染色阳性，钙化结节 Von Kossa k色阳性。结论：本实验在体外 成功培养出了大鼠颅骨成骨细胞。 二、大鼠颅骨成骨细胞Cbfal CDNA片段的克隆和序列测定 目的：从体外培养的大鼠颅骨成骨细胞中克隆出Cbfal CDNA片段，为 进一步的抗体和探针制备奠定基础。方法：采用RT－PCR方法。结果：从大 鼠颅骨成骨细胞总RNA中克隆出约700hp大小的Cbfal CDNA片段，测序结 果与GenBank检索到的相同。结论：本实验成功克隆出了大鼠的cbfa cDNA 片段。 三、大鼠Cbfal CDNA肽段在大肠杆菌中的表达和纯化 3 第四军医大学博士学位论文4 目的：在大肠杆菌中表达cbfal cDNA肽段，制备。bfal纯化蛋白，为抗 体的制备奠定基础。方法：构建重组质粒，诱导蛋白表达，用＊ 柱亲、和层析纯化融合蛋白。结果：在构建的重组质粒中正确插入了约200hp的 cbfal cDNA片段，在大肠杆菌表达并纯化后获得纯度大于95％的cbfal融合 蛋白。结论：本实验在体外以大肠杆菌为宿主菌表达出了Cbfal多肽片段， 获得了高纯度的Cbfal融合蛋白。 四、大鼠 cbfal 多克隆抗体和 cDNA探针的制备 目的：制备Cbfal多克隆抗体和。DNA探针，为免疫组化和原位杂交研 究奠定基础。方法：用新西兰大白兔进行动物免疫，兔抗血清进行分离和纯 化。用双向免疫扩散试验、蛋白印迹和免疫组化方法进行鉴定。Cbfal重组质 粒扩增后酶切，用随机引物法对回收的Cbfal CDNA片段进行地高辛标记。 结果：制备的Cbfal多克隆抗体经双向免疫扩散试验、蛋白印迹检测、新生 大鼠颅骨组织石蜡切片和 MG－63骨肉瘤细胞免疫组化染色鉴定，均为阳性结 果。制备了地高辛标记的Cbfal CDNA探针。结论：本实验成功制备了Cbfal 多克隆抗体和 CDNA探针。 五、人牙周膜细胞在弹性牵张力作用下Cbfal的表达 目的：探讨人牙周膜细胞在张应力作用下的成骨特性和Cbfal在正畸成骨。中的作用机制。方法：体外原代培养人牙周膜细胞，弹性膜及体外培养细胞 加载系统加载弹性牵张力，免疫组化和原位杂交方法检测人牙周膜细胞在弹 性牵张力作用下cbfal在蛋白水平和基因水平的表达。结果：体外原代培养 4 第四军医大学博士学位论文5 的人牙周膜细胞形态为短梭形和长梭形，细胞呈放射状生长；加力后的人牙