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作为重要工业用酶之一的脂肪酶,其在生物能源、化妆品、精细化工、皮革、油脂、饲料、食品等众多行业内应用普遍。几乎所有微生物、动植物体内均有脂肪酶。微生物则提供了大部分商业化脂肪酶。和真菌脂肪酶相比,细菌脂肪酶在有机相、水相内不但有更多的催化反应种类,而且其稳定性与反应活性更高。在细菌脂肪酶中,性能最佳的当属Pseudomonas(假单胞菌属)脂肪酶。不过,细菌脂肪酶产量一直较低,这种现象也始终无法通过常规培养基、育种等技术手段取得实质性进展,因此必须全面阐明细菌脂肪酶的基因表达调控分子机理,才有可能获得有效的基因操作策略。由于Pseudomonasprotegens(防御假单胞菌)Pf-5本身就是一种优秀的生防菌,所以不少学者都在对其进行研究。但尽管如此,关于P.protegens Pf-5脂肪酶的研究基本上没有什么报道。基于以上原因,本论文以P.protegens Pf-5为研究对象,研究了其脂肪酶LipA的表达调控网络,探讨了两个基因调控脂肪酶表达的分子机理。希望通过本研究为了解假单胞菌脂肪酶基因表达的调控网络,构建高效表达脂肪酶基因工程菌奠定坚实理论基础。本研究的主要工作和创新摘要如下:1.在P.protegens Pf-5中成功构建了脂肪酶lipA调控基因的筛选方法和体系。采用gfmut2为报告基因,利用转座子pRL27随机插入突变方法筛选lipA的调控基因,建立了库容达15,000株左右的转座子突变体库,共筛选得到4株候选突变株,并找到了 4株候选突变株的基因突变位置。对可能会影响lipA表达的这四个基因进行了生物信息学分析,预测了其功能与结构。在本筛选体系中,我们在LB平板中加入碳粉后,通过肉眼就可以观察到绿色荧光的表型差异,极大方便了后续突变株筛选过程,而且假阳性极少。本体系为全方位研究脂肪酶的表达调控提供了一个极有力的工具,而且该体系还可用于假单胞菌属其他基因表达调控的研究,为后期开展基因表达调控研究提供一个有效的技术平台。2.通过 algR、hfq、rsmY、rsmZ 编码区敲除,algR、hfq、rsmY、rsmZ过表达,lacZ的融合表达、EMSA、脂肪酶活力测定等,首次证明了 AlgR通过与rsmZ启动子区域直接结合来激活lipA表达,而且以转录水平的影响为主;而Hfq则是直接与rsmY结合,通过维持rsmY的稳定性来影响lipA的翻译。这也是在Pf-5中首次发现AlgR、Hfq能够影响lipA的表达。而且不管是AlgR还是Hfq,都需要通过小分子RNA——Rsm系统来发挥作用。3.通过将rsmY,rsmZ编码区敲除,以及染色体整合型lipA’-’lacZ和lipA-lacZ融合表达、qRT-PCR分析以及染色体整合型rsmA’-lacZ和rsmE’-’lacZ融合表达,分析了 rsmY、rsmZ对脂肪酶lipA的表达影响,同时也分析了 rsmY以及rsmZ对rsmA、rsmE的表达影响,发现rsmY、rsmZ主要是通过rsmE来调控lipA的表达。4.以上结果表明,在假单胞菌Pf-5中,lipA的表达调控受多个基因的影响,AlgR通过AlgR-rsmZ-rsmE-lipA途径,而Hfq则是通过Hfq-rsmY-rsmE-lipA途径来影响脂肪酶lipA的表达。同时,也表明不管是AlgR还是Hfq,它们都需要通过Rsm系统来发挥调控作用。这些结果有助于更进一步地了解细菌脂肪酶基因表达调控的分子机理,为后续研究构建脂肪酶高效表达的基因工程菌提供理论依据和一些新的思路。