目的：　　1.探讨音猬因子（Sonic hedgehog, Shh）信号通路在体外培养的人骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用。　　2.探讨Shh信号通路在体外培养的人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的作用机制。　　方法：　　1.实验分组：0μmol/L，25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L，200μmol/L，应用MTT法检测各组细胞在给药后培养第1、2、3天的细胞活力。　　2.实验分组：空白组，诱导组，不同浓度Shh药物组（25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L，200μmol/L），诱导培养的第7天进行碱性磷酸酶（ALP）染色和ALP活性定量以检测细胞的分化情况，在第14天进行茜素红染色及钙结节定量以观察细胞的矿化情况。　　3.给予 Shh蛋白培养，实时定量 PCR技术检测第7天成骨标记基因Runt-related transcription factor2（Runx2）、Osterix（Osx），osteopontin（OPN）的表达水平。Western blot技术检测Runx2和Osx的表达水平。　　4.实时定量PCR技术检测第7天Shh信号通路活化标记基因Gli1，histone deacetylase4（HDAC4）的表达水平　　5.实验分组为：诱导组、Shh蛋白组、Shh通路抑制剂环巴胺（Cyclopamine）组、Shh蛋白+Cyclopamine组。分别在干预的第7天进行ALP染色和ALP活性定量，第14天进行茜素红染色及钙结节定量。　　6.给予Shh通路抑制剂Cyclopamine干预后再给予200μmol/L Shh处理细胞，Western blot检测OPN，osteocalcin（OCN）蛋白水平　　结果：　　1.在成骨诱导液作用下人骨髓间充质干细胞表现出成骨细胞特性：碱性磷酸酶染色阳性，茜素红染色可见特征性钙结节形成。　　2. Shh蛋白在25μmol/L~200μmol/L范围内对人骨髓间充质干细胞的增殖无显著影响。　　3.25μmol/L~200μmol/L Shh蛋白对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响：　　（1） Shh蛋白抑制人骨髓间充质干细胞的成骨分化，表现为ALP染色颜色变浅及ALP活性呈浓度依赖性下降（P<0.01）。　　（2） Shh蛋白抑制人骨髓间充质干细胞的矿化，呈剂量依赖性减少人骨髓间充质干细胞钙结节的形成（P<0.01）。　　4.实时定量PCR结果显示，与诱导组相比，成骨相关标记基因Runx2、Osx和OPN的表达量呈浓度依赖性下降；Western blot结果显示，与诱导组相比，Runx2和Osx蛋白呈浓度依赖性下降。　　5.实时定量PCR结果显示，通道活化标记基因Gli1和HDAC4的表达量明显升高，并呈浓度依赖性；Western blot结果显示，与诱导组相比，HDAC4蛋白表达呈浓度依赖性升高；　　6.加入通路抑制剂Cyclopamine后的分化矿化实验结果显示，Cyclopamine可减轻Shh对ALP活性和矿化结节形成的抑制作用（P<0.01）。　　7. Western blot结果显示，Cyclopamine可逆转Shh对OPN，OCN蛋白表达的抑制作用（P<0.01）。　　结论：　　1. Shh信号通路的激活对体外培养的人骨髓间充质干细胞成骨分化有抑制作用。　　2. Shh信号通路抑制体外培养的人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用机制可能是通过升高HDAC4，从而抑制成骨相关基因Runx2、Osx、OCN及OPN的表达。