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本文采用 CODEHOP策略设计简并引物,从橙色红曲菌(Monascusaurantiacus)的基因组 DNA中克隆得到 pyrG基因片段,然后运用 PCR法筛选红曲菌 Fosmid文库,获得了 pyrG基因全长。以橙色红曲菌 AS3.4384为出发菌株,经紫外诱变获得尿嘧啶依赖型的5-FOA抗性菌株,经测序和基因转化试验鉴定出UM28为pyrG缺陷株。对PEG介导的转化方法优化后建立了以 pyrG为筛选标记的红曲菌同源转化系统,并构建了含有GFP蛋白的表达载体 pGFP-pyrG,通过基因转化试验,在红曲菌中以 pyrG为筛选标记进行了GFP蛋白的表达。主要研究内容如下:
1.根据已报道的真菌乳清苷-5-磷酸脱羧酶基因(pyrG)的氨基酸序列,采用 CODEHOP策略设计简并引物,从橙色红曲菌的基因组 DNA中克隆得到pyrG基因片段。然后运用 PCR法筛选红曲菌 Fosmid文库,获得了 pyrG基因全长(GenBank登录号:GU723506)。经过 blastx比较发现,红曲菌 pyrG基因与 Aspergillus flavus NRRL3357的氨基酸序列同源性最高,达到81％。该基因能够作为筛选标记应用于红曲菌同源转化系统;
2.以橙色红曲菌 AS3.4384为出发菌株,经紫外诱变得到一株尿嘧啶依赖型的5-FOA抗性菌株 UM28。扩增其 pyrG基因并进行测序,发现 UM28的pyrG基因在核苷酸序列+220 bp的位置发生了突变,进而导致氨基酸水平上Pro→Ser的突变,造成了乳清苷-5-磷酸脱羧酶的失活。UM28通过基因转化能够接受含有米曲霉 pyrG基因的互补质粒恢复野生表型,且回复突变率低于10-8,能够用于红曲菌同源转化系统的构建;
3.对 UM28菌株的原生质体制备、再生和转化方法进行了优化,采用原生质体 PEG介导转化将互补质粒 pAOP和 pMAP分别转入 UM28中,能够使其恢复野生表型。建立了以 pyrG为筛选标记的红曲菌同源转化系统;
4.通过 DNA重组技术构建了表达载体 pGFP-pyrG,载体中含有 pyrG筛选标记和 GFP蛋白表达单元。通过基因转化试验,在红曲菌中以 pyrG为筛选标记进行了 GFP蛋白的表达。