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目的:1.构建ARA55基因的真核表达载体并完成相关鉴定,研究ARA55基因过表达对CNE2鼻咽癌细胞生物学特性的影响;2.明确ARA55在TGFβ1介导的CNE2细胞上皮间质转化(EMT)及侵袭、迁移中的作用。方法:1.通过PCR扩增获得ARA55基因全长cDNA序列,纯化后用HindIII和XhoI双酶切消化,经T4DNA连接酶作用,连接至pCMV-C-EGFP真核表达载体,连接产物经转化、挑取克隆、扩增培养后,提取小量质粒,进行DNA测序鉴定;用HindIII和XhoI内切酶消化酶消化连接产物,琼脂糖凝胶电泳鉴定。重组质粒经ZLip2000转染至CNE2鼻咽癌细胞,荧光显微镜观察EGFP的表达情况,免疫印迹检测ARA55-EGFP融合蛋白的表达水平;通过CCK-8比色、划痕修复实验、Transwell小室、AnnexinV-PE/7-AAD双荧光染色、DNA梯状电泳及蛋白印迹检测凋亡蛋白变化等实验,探讨ARA55过表达对CNE2鼻咽癌细胞生物学特性的影响。2.利用一定浓度的TGFβ1诱导CNE2细胞株中ARA55的表达,免疫印迹检测ARA55蛋白及EMT相关标志物N-cadherin、Claudin-1等的表达变化;采用ARA55的siRNA质粒,经X-tremeGENEsiRNA转染至CNE2细胞株;通过CCK-8比色、划痕修复、Transwell侵袭迁移等实验,研究TGFβ1介导的ARA55表达上调及沉默以ARA55表达对CNE2鼻咽癌细胞EMT及侵袭迁移的影响。结果:1.DNA测序及双酶切分析显示pCMV-ARA55-EGFP重组载体构建成功。2.CCK-8比色、划痕修复实验、Transwell小室等结果显示pCMV-ARA55-EGFP组细胞生长增殖、侵袭迁移能力明显低于pCMV-C-EGFP空载体组和/或空白对照组(P<0.05或0.01);AnnexinV-PE/7-AAD双荧光染色及DNA梯状电泳结果可见,pCMV-ARA55-EGFP组细胞产生凋亡,且凋亡率明显高于pCMV-C-EGFP空载体组(P<0.05);免疫印迹显示pCMV-ARA55-EGFP组细胞Bcl-2表达下调,CytochromeC表达上调,同时伴有Caspase-9和Caspase-3的激活。3.TGFβ1诱导后,免疫印迹显示ARA55在CNE2细胞中的表达上调;ARA55诱导组细胞发生间质样改变,N-cadherin的表达上升,Claudin-1表达下降,同时细胞的生长增殖及侵袭迁移能力明显高于对照组(P<0.05或0.01);诱导表达的ARA55通过siRNA下调后,siRNA-ARA55组细胞生长增殖及侵袭迁移能力下降(P<0.05或0.01)。结论:1.成功构建pCMV-ARA55-EGFP重组载体;2.ARA55过表达可抑制CNE2鼻咽癌细胞生长增殖,诱导凋亡;3.ARA55参与了TGFβ1介导的CNE2细胞EMT及侵袭迁移过程。