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背景急性胃粘膜损伤(AGML)是临床上常见的围术期并发症,其具体的发病机制至今仍未完全明确。目前普遍认为胃粘膜缺血是AGML发病的主要环节。我们课题组前期已通过大鼠的浸水束缚应激模型,分别从损伤性应激和非损伤的心理应激等层面探讨了 AGML的发病进程。然而却一直未从缺血的角度探讨AGML的发生机制及可能的防护措施。乌司他丁(UTI)作为一种广谱尿胰蛋白酶抑制剂,具有减少氧自由基、稳定溶酶体膜、减轻炎症、改善循环等作用。研究表明UTI对危重患者肠粘膜具有保护作用,但其对胃粘膜是否也有保护作用尚无报道。目的本研究采用人胃粘膜上皮细胞株(GES-1),运用氧糖剥夺(OGD)方法来构建细胞的缺氧缺糖模型,单纯从“缺血”角度研究胃粘膜损伤的机制,并观察UTI预处理是否对损伤的细胞有保护作用。内容与方法1.构建GES-1细胞株的OGD模型:采用无糖培养基和三气培养箱对GES-1细胞给予不同的OGD时间(0、2、4、6、8h),用CCK-8法检测细胞活力,Hoechst染色法和流式细胞仪检测细胞凋亡,免疫印迹法检测Bcl-2,Bax蛋白的表达;2.摸索UTI合适的作用浓度:将GES-1细胞按顺序分别加入浓度为0、100、200、400、800、1000U/mL 的 UTI,作用 12h 后进行 CCK-8 法检测,发现 1000 U/ml组细胞存活率较OU/ml组明显下降(P<0.01),而其余组细胞存活率无明显变化。故在OGD损伤6h前,去掉1000U/ml浓度组,将细胞随机分为正常对照组、氧糖剥夺组、不同浓度UTI预处理组(UTI浓度分别为100、200、400、800U/mL),处理后用CCK-8法检测;3.探索UTI减轻GES-1细胞OGD损伤的机制:GES-1细胞随机分为正常对照组(N组)、氧糖剥夺组(O组)、UTI预处理组(U组)。N组不做任何处理,O组和U组细胞均进行OGD处理6h,且U组细胞在OGD前先用800U/ml UTI提前作用12h。处理后,用CCK-8法测定细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫印迹法检测Caspase-3和Cleaved Caspase-3的蛋白表达水平,实时荧光定量PCR法检测细胞内TRPV1 mRNA的表达水平。结果1.检测结果显示,随着OGD时间的延长,细胞活力明显下降,凋亡细胞明显增多,凋亡率显著上升,凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值逐渐增加(P<0.01或P<0.05)。2.与氧糖剥夺组比较,细胞存活率在UTI浓度提高到400U/ml和800U/ml时明显增加,且在UTI浓度为800U/ml时细胞存活率最高(P<0.01)。3.结果显示,与N组比较,O组细胞存活率显著降低,凋亡率增加,Caspase-3 和 Cleaved Caspase-3 表达增加,TRPV1 mRNA 表达降低(P<0.05);而 UTI预处理能显著抑制上述O组的变化,差异具有统计学意义。结论利用无糖培养基和三气培养箱可成功构建GES-1细胞的OGD模型,能较好地观察缺氧缺糖对胃粘膜上皮细胞的损伤情况;UTI预处理可减轻GES-1细胞OGD损伤,其保护机制可能与减少细胞凋亡以及对TRPV1的上调相关。